利用网络药理学分析白术当归七物汤治疗结直肠癌的作用及机制

张士林，李敏，陈辉，孙文，项灵云,，冯觉平★

（1.湖北中医药大学，湖北 武汉；2.武汉市第四医院（华中科技大学同济医学院附属普爱医院）肿瘤科，湖北 武汉；3.江汉大学，湖北 武汉）

0 引言

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是胃肠道中最常见的恶性肿瘤之一，手术、放化疗及分子靶向是其主要治疗手段[1]。近年来研究表明，中医药对CRC 有较好的辅助治疗效果[2]。

结直肠肿瘤归属于中医的“肠覃”“肠风”“积聚”“肠积”“锁肛痔”等，现代中医认为CRC 的病因为癌毒发于内，瘀结于肠腑，与多种病邪互结，导致机体正气失衡，无法抵御癌毒[3-4]。故通过辨证诊治，采用化瘀散结、补益气血等方法治疗[5-6]。白术当归汤由归脾汤化裁而来，药物组成为白术、当归、茯苓、黄芪、木香、甘草、白药蛇舌草。取其补益气血，健脾养心之功效。但有关白术当归汤治疗CRC 机制的网络药理学研究尚未见报导，本研究基于网络药理学方法、白术当归汤的化学成分、化学分子靶标、CRC 相关基因-蛋白相互作用等信息，构建“中药化合物活性成分靶点蛋白互作网络”“中药化合物活性成分靶点-肠癌靶点蛋白互作网络”，系统探讨白术当归汤治疗肠癌的多成分、多靶点、多通路复杂机制，为后续研究提供信息。

1 资料和方法

1.1 白术当归七物汤的活性成分及靶点筛选

本研究依托于中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以白术当归七物汤的组成成分：白术、当归、茯苓、黄芪、木香、甘草、蛇草；检索本方所有化学成分，以生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥40%和类药性（Druglikeness，DL）≥0. 2 作为活性化合物的筛选条件，提取相应的活性成分。应用TCMSP 数据库平台检索白术当归汤所有活性成分的靶基因。

1.2 大肠癌的疾病靶点筛选

GeneCard 数 据 库（https：//www.genecards.org/）及OMIM 数据库（https：//omim.org/）中，以“Colorectal cancer”为检索词，筛选得到CRC 的靶点，并应用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）对所筛选的靶点标准化。

1.3 活性成分与CRC 共同靶点筛选

应用R 语言（https）软件3.6.2，通过编程将CRC 靶点与药物靶点进行交集，并绘制韦恩图。

1.4 Protein-protein interaction（PPI）网络构建

CRC 与药物共同靶点输入在STRING（http：//string-db.org/cgi/input.pl）数据中，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”，构建共同靶点互作用网络PPI，评分条件设定为大于0.4，保证信息的置信度，隐藏孤立蛋白质，其他参数保持默认设置，获得PPI 网络。应用count.R 插件获得共同蛋白靶点出现的频次。

1.5 白术当归七物汤药物活性成分-CRC-靶点互作用网络构建

利用Cytoscape 3.7.2 软件中Merge 功能构建白术当归七物汤药物活性成分-CRC-靶点互作用网络。网络图中“Node”代表活性成分和靶点，“Edge”代表活性成分-CRC-靶点之间的相互关系。

1.6 差异基因GO（Gene Ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因组百科全书）通路富集分析

利用R 语言（http）软件对白术当归七物汤药物活性成分与CRC 的共同靶点进行GO 分析，GO 分析主要用于描述基因产物的功能，包括细胞功能、分子功能和生物功能。并应用ClusterProfileKEGG.R 工具包进行KEGG Pathway 富集分析。

2 结果

2.1 白术当归汤活性成分筛选

通过TCMSP 数据库按照既定的筛选条件，去掉重复成分后获得生物活性成分（83）个，表1。

2.2 CRC 的靶点筛选

通过检索GeneCards、OMIM 数据库得到CRC 的治疗靶点，共得到8573 个CRC 的相关致病与治疗基因。

2.3 活性成分与疾病共同靶点筛选

白术当归七物汤的83 个活性成分相关治疗靶基因经标准化后（不能标准化的予以删除）与CRC8573 个疾病靶点交集共178个，得到Venny 图（图1）。

图1 白术当归七物汤活性成分靶基因与CRC 疾病基因交集Venn 图

表1 白术当归汤7 味中药TCMSP 数据库筛选的生物活性成分

续表1

图2 白术当归七物汤蛋白相互作用网络图

2.4 PPI 网络构建

在STRING 数据平台中，输入178 个共同靶点名称，按照既定的检索条件构建蛋白互作网络图（图2），利用COUNT.R 插件统计出现频次前20 的蛋白靶点，出现频次较高的AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、JUN、CASP3 蛋白靶点等，并绘制条形图（图3）。

图3 白术当归七物汤治疗CRC 相关的高频蛋白靶点

2.5 白术当归七物汤活性成分-CRC-靶点互作用网络构建

利用Cytoscape3.7.2 软件在活性成分-CRC-靶点互作网络图中，共获得255 个节点和1254 条边（包括中间的疾病与药物及关系）（图4），其中红色代表CRC，蓝色代表药物白术当归七物汤，紫色代表白术当归汤活性成分，黄色代表白术当归汤与CRC 的共同靶点。

图4 白术当归汤的活性成分-CRC-靶点相互作用网络图

2.6 GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

利用R 软件对178 个共同靶点进行GO 功能分析得到的柱状图（图5）、气泡图（图6）及KEGG 富集结果（图7）。本结果中共有42 个信号通路富集靶点数目大于等于20。通过分析，共同靶点主要分布在Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection（卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染）、Hepatitis B（乙型肝炎）、Human cytomegalovirus infection（人 巨 细 胞 病 毒 感 染）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路）、Fluid shear stress and atherosclerosis（脉冲剪切力与动脉粥样硬化）等多条信号通路中。图8 则基于卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路为例，显示出白术当归七物汤治疗CRC 的靶点。

3 讨论

中草药在CRC 辅助治疗中越来越被广泛应用，它在改善症状、提高患者免疫能力等方面发挥了一定的作用。然而传统的中草药组方多为个体经验，差异较大，因而常常无法客观、有效地评估疗效。组方之间的协同作用也无法提供更为科学的依据，其作用机制也无法系统研究，因而不被国际学术界广泛认可与接受。

网络药理学是在“药物成分-靶点-疾病”相互作用网络的基础上，观察药物与疾病内在关联并分析多种药物协同作用的一种方法[7]。利用网络药理学研究中药复方的作用及其机制更为科学、系统，因而逐渐成为热点。

图5 GO 功能分析柱状图

图6 GO 功能分析气泡图

图7 KEGG 富集分析结果

图8 白术当归七物汤作用于Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection 信号通路（红色表示可能靶点）

CRC 属于中医的“积聚”“肠积”等范畴，常常表现为血便、腹痛、便秘、腹泻。历代医家对其治疗见解各异，如汉唐主张通络去瘀，宋金则以痰瘀论治，明清时期医家则是以瘀为主，并主张泻下攻积等多法灵活运用[8,9]。本方结合现代中医思想，认为CRC 仍癌毒发于内，瘀结于脏胕，与多种病邪混合互结，致正气消亡[3]，故以补益气血，健脾养心的归脾汤为基础化裁而来。方中以黄芪、白术、甘草甘温之品补脾益气以生血，使气旺而血生；当归、茯苓补血养心安神；木香辛香而散，理气醒脾；蛇草抑癌消瘀。组方具有一定的综合性。本研究以网络药理学方法分析后获得83 个活性成分，使得临床白术当归七物汤的使用有了可供研究的基础，也为后续在白术当归七物汤基础上加减药物治疗CRC 提供了科学指导。

经过将白术当归七物汤的83 个活性成分相关治疗靶基因经标准化后获得与CRC 相关的靶点共178 个，其中包括靶点为AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、JUN、CASP3 等，提示白术当归七物汤主要可能通过作用上述基因表达蛋白发挥抗肿瘤作用。

在获得有效成分的基础上，通过白术当归七物汤成分-靶点网络分析观察到，频次较高的有AKT1（丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶）、IL-6（白细胞介素6）、VEGFA、MAPK3 等通路上的靶点。而GO 分析及KEGG 通路筛选显示，共同靶点主要分布在Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Human cytomegalovirus infection、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis 等多条信号通路中。提示白术当归七物汤可通过AKT1、IL6、VEGFA、MAPK3 等多靶点、多通路、多途径治疗CRC，且白术、当归、茯苓、黄芪、木香、甘草、白药蛇舌草治疗CRC 具有协同作用。

AKT1 是一种丝氨酸/ 苏氨酸激酶，是磷脂酰肌醇3- 激酶（PI3K）/AKT1 信号转导通路下游的主要作用靶点。AKT1 在CRC 的发生发展中，活化释放细胞存活信号，通过磷酸化激活，抑制其下游的多种作用底物，促进肿瘤细胞的生长、增殖、分化，抑制肿瘤细胞的凋亡[10]。P13K/AKT 参与肿瘤血管生成的调控，促进肿瘤血管的生成，并促进恶性肿瘤细胞的侵袭与转移，增强肿瘤细胞对化学疗法以及放射疗法的抵抗性[11,12]。IL-6 是连接炎症与肿瘤的关键炎症因子[13]，并在多种肿瘤中异常表达[14]。而且通过参与多条信号通路如Janus 蛋白酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）信号通路，Ras 蛋白、细胞外信号调节激酶（ERK）及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，以及PI3K/AKT 信号通路来调控肿瘤的生长、增殖、分化、转移及侵袭[15]。有多项研究表明抑制IL-6 对多种肿瘤有治疗效果[13,16-18]。血管内皮生长（VEGF）是目前已知特异性最好、作用最强的促血管生成因子[19,20]。其中VEGFA 是其相关基因家族中在组织和细胞中含量最丰富、功能最强大的，在血管新生中起关键作用[19]。VEGF 可与其受体结合促进血管内皮细胞的增殖迁移，从而介导血管的生成[21]，对实体肿瘤的发生进展有重要促进作用[22]。

在我们的研究中，白术当归七物汤仍然是通过抑制肿瘤增殖转移、诱导凋亡、抗血管生成等经典通路发挥抗肿瘤作用，这与传统的抗CRC 药物如奥沙利铂、5- 氟尿嘧啶（5-FU）、卡培他滨等药物有相似之处。这一方面表明，使用白术当归七物汤治疗CRC具有一定的科学根据，另一方面也为我们后续针对白术当归七物汤的药物有效成分研究提供了基础，有可能从中能提取抗CRC 的核心化合物而进一步开发。

总之，白术当归七物汤是通过多靶点、多通路、多途径治疗CRC，且白术、当归、茯苓、黄芪、木香、甘草、白药蛇舌草治疗CRC具有协同作用。进一步有待于从白术当归七物汤中筛选出最有效的化合物成分开发运用。并在在此基础上探索该药物在肺癌、膀胱癌、胰腺癌及前列腺癌等恶性肿瘤中的疗效。