墨囊多酚氧化酶在红茶加工中的应用研究

江津津，姚晓静，欧爱芬，刘慧娟，陈烽华

(广州城市职业学院 食品系，广东 广州 510405)

酶，是生物为了提高其生物化学的反应效率而产生的高效生物催化剂。生物体内，所有的反应均在酶的催化下完成，而且选择性极高[1]。多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，简称PPO)是自然界中分布极其广泛的一类含铜氧化还原酶[2]，多酚氧化酶化学性质稳定，并且普遍存在于植物、真菌、昆虫等质体中，甚至在土壤里腐烂残败的植物碎渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性[3]。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。中外许多研究者已对虾类、果蔬和菌类中的多酚氧化酶的特性都进行过大量研究，但是以墨鱼囊为研究对象，提取纯化并研究其墨囊中的多酚氧化酶，国内外报道很少。随着对多酚氧化酶的深入研究，发现其酶制剂可用于红茶制造[4]。使用多酚氧化酶对茶饮料的品质有一定的提高效果[5]，它可催化茶叶中的多酚类氧化生成醌类，后者进一步聚合生成茶色素、茶多酚等与红茶品质的形成密切相关。茶色素是茶叶中多酚类与其氧化衍生物的混合物，主要成分为茶黄素类、茶红素和茶褐素，不仅是红茶汤色“亮”的主要成分，同时也是汤色强度和鲜爽度的重要因素，对红茶色泽、香味以及口感等品质起着决定性的作用。茶色素不仅可由红茶提取而得到，还可以由多酚氧化酶发生酶促氧化而制得[6-7]。茶饮料加工就是利用酶具有的这种特性，用技术手段钝化或激发酶的活性，使其沿着茶类所需的要求发生酶促反应而获得各类茶特有的色香味。目前用于茶饮料的PPO多为进口的酶制剂，价格昂贵，成本高。如能从水产加工废弃物中提取出天然高效的PPO,并应用于红茶加工，则经济效益可观，并有利于水产资源的综合利用。有研究者报道头足类动物墨鱼体内的墨囊蕴含有高效的PPO，墨鱼墨囊为水产加工废弃物，而且墨鱼墨汁已被应用于面条加工等食品，已被证实食用安全。开发新的可应用于茶饮料生产的高效、经济的酶资源前景可观，因此，墨鱼墨多酚氧化酶具有良好的利用价值。随着制茶工艺学的发展和各门科学技术的相互渗透，可以预见，天然墨鱼墨多酚氧化酶应用于红茶饮料加工是很有前景的。

一、研究内容

(一)墨鱼墨囊中提取的多酚氧化酶及其特性

以墨鱼墨囊为原料，溶于0.05mol/mL pH7.2磷酸盐缓冲液中并冷冻离心提取，再经过30%-80%硫酸铵分级沉淀，以多巴溶液为底物，利用紫外分光光度计测其在475nm处吸光度每分钟的变化值，从而检出其PPO酶活力。

(二)PPO应用于红茶饮料加工的工艺研究

把PPO添加到红茶饮料中反应后再进行检测。利用紫外分光光度计分别测得溶液在269nm、274nm、375nm处的紫外吸收值，从而反映茶色素，特别是茶黄素的生成情况，为PPO在茶饮料加工中的应用工艺提供一份分析评价的实验数据。在添加酶浓度、溶液pH、反应温度三个单因素实验基础上，再进行三因素三水平正交实验，通过分析得到最优工艺条件。最后通过感官评定测试最优工艺条件下的产品与实际感官最优产品是否一致。

二、材料与方法

(一)原料与仪器

云南凤庆滇红功夫红茶，新鲜墨鱼墨囊(广州黄沙水产批发市场)，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，硫酸铵，左旋多巴(DL-DOPA)，以上试剂均为分析纯。UV-1800PC紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)，高速台式冷冻离心机(上海圣科仪器设备有限公司)，万分之一天平(赛多利斯有限公司)，电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，精密pH计(上海雷磁有限公司)，电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)。

(二)方法

1.墨囊PPO的提取与酶活测定

PPO的提取：称取墨鱼墨50克，加200 mL 0.05mol/LpH7. 2的磷酸钠缓冲液。温和搅拌1小时，再将提取液于15000g冷冻离心机中离心30min，汲取上清液作为粗酶液。所有纯化操作均在4℃条件下进行。硫酸铵分级沉淀：根据粗酶液体积(mL)和(NH4)2SO4的饱和度常用表计算出要达到30%饱和度时所需的固体(NH4)2SO4粉末的量，称量并研细后边搅拌边缓缓加入粗酶液中，静置30分钟，将溶液移入离心管中，15000g离心30分钟。弃去沉淀，记录上清液的体积。再次根据上清液的体积和(NH4)2SO4饱和度常用表计算达到40%饱和度需(NH4)2SO4的加入量，重复前述离心方法，直至达到80%硫酸铵饱和度沉淀分离结束。去除清液及其悬浮物，将沉淀溶于最小体积的0.05 mol/LpH7.2的磷酸缓冲液中。

PPO酶活力测定： 以2.98 mL的5mmol/L的配制在0.05 mol/LpH7.2的磷酸钠缓冲液中的多巴 (D,L-3,4-二经苯丙氨酸，Sigma公司) 溶液为底物，反应池中加入0.02mL酶液混匀。参比池用 0.05 mol/L pH7. 2的磷酸钠缓冲溶液代替酶液，其它条件均与反应池相同。使用紫外可见分光光度计在波长475 nm处测定酶活力。记录每分钟引起A475nm变化0.001所需的酶量。

2.PPO应用于茶饮料的研究

PPO在茶饮料加工中参与一系列酶促活动引起的化学变化。茶色素是从茶叶中提取的一类水溶性酚性色素，主要分为茶红素、茶黄素和茶褐素。PPO的酶促氧化主要形成茶色素中的茶黄素，而茶黄素是红茶汤色亮的主要成分，其含量愈高，茶饮料品质愈好[8]。由此本研究主要以茶黄素生成情况来判定最优工艺条件。茶黄素跟茶褐素在紫外波长270nm左右有吸收，其中茶黄素在波长272-275nm范围内有最大吸收，茶红素、茶黄素和茶褐素在波长380nm处左右均有吸收。利用紫外分光光度计，通过以蒸馏水为对比，与参照样分别在269nm、274nm和375nm处测定各样品的紫外吸收值，通过吸收值高低来表征在墨鱼墨PPO的作用下，茶色素的生成情况，再通过感官量化分析试验，结合消费者的感官评价来确定墨鱼墨PPO添加到红茶饮料加工的最优工艺参数。

3.正交实验方法

单因素实验：根据单因素实验结果，确定较优因素值,各个因素选取三个优水平设计进行下一步三因素三水平正交实验,并进行重复试验。因素水平表如表1所示。

表1 正交试验因素水平表

4.统计方法

采用SPSS12.0和Excel进行数据处理，差异性分析(ANOVA)被用来检查各个不同结果的平均值间的显著性差异，采用3个平行，取95%置信度(P<0.05)。

感官量化描述分析(QDA)：以云南凤庆滇红功夫红茶为原料，通过纯净水浸泡和墨鱼墨PPO酶加工，过滤得到浸提液，生产出编号为1-9的9个样品，不同编号的样品生产工艺条件对应不同试验号，样品号与试验号对应。制作完9个样品后进行感官量化分析，本次感官评定选用8名评价员(2男6女) ，按照红茶饮料的感官评定表(表2),按照颜色、滋味、香气这三种感官对9个样品进行评分[9]，然后根据数据统计制成雷达图。

表2 红茶饮料感官评定表

三、结果与分析

(一)墨鱼墨PPO纯化结果与分析

墨鱼墨PPO提取纯化结果如表3所示。

实验结果表明墨鱼墨囊中PPO酶活性很强，酶粗液经过纯化处理后，PPO酶活性大大提高。原来的粗酶液中PPO活性较低，经硫酸铵分级沉淀后，活性提升较大，纯化倍数提高了3.09。

(二)PPO应用于红茶饮料的结果与分析

1.单因素实验结果

考虑PPO应用到红茶饮料加工的主要影响因素，根据参考文献中外源酶在茶叶加工中的应用方案设计了添加酶浓度(体积百分比)、根据PPO酶的特性设置了反应温度、pH三个因素的单因素实验(表1)。为正交试验做准备，提供合理的数据范围和参数。单因素实验结果如图1、图2、图3所示。

0.60.50.40.30.20.10吸光度A添加酶浓度/%0.020.040.060.080269nm274nm375nm

图1 酶浓度对吸光度的影响

图2 温度对吸光度的影响

图3 pH对吸光度的影响

由图1可知PPO添加酶浓度体积百分比在0.01%、0.03%和0.05%最为合适，据文献也与大多数多酚氧化酶作用于茶饮料加工的添加酶浓度相符[10]，当添加酶浓度超过0.05%时曲线趋于平缓。由图2可知反应温度在40℃、50℃和60℃最合适,温度高于60℃时PPO活性下降迅速。由图3可知，最适pH值在6.0,7.0和8.0,这个pH范围也符合大多数多酚氧化酶的最适pH值。

2.正交试验结果与分析

正交试验利用正交表来对试验进行整体设计、比较兼统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，每次试验都具有较强的代表性，保证了整体实验的全面客观性。而由图1、图2和图3可知分别可选择添加酶浓度0.01%、0.03%、0.05%，反应温度40℃、50℃、60℃和pH6.0、pH7.0、pH8.0进行正交试验，对PPO在红茶饮料加工工艺进行正交实验得到最优实验方案，见表4。

表3 墨鱼墨PPO纯化结果

表4 正交试验结果

其中紫外吸收波长269nm处以K1、K2、K3、k1、k2、k3、R表示，274nm处以K1’、K2’、K3’、k1’、 k2’、 k3’、R’表示，375nm处则以K1”、K2”、K3”、k1”、 k2”、 k3”、R”表示。由表4可知，影响PPO作用生成茶色素的主次因素是B>A>C，即反应温度是最大的影响，其次是添加酶浓度，最后是溶液pH。对试验结果进行极差分析得出优方案为A3B3C2，且优方案与正交表中最好的第9试验A3B3C2一致，所以优方案符合实际，即为添加酶浓度为0.05%，反应温度为60℃，pH值为7.0。

3.感官量化分析(QDA)结果与分析

感官评定实验是食品的研究开发过程主要用来分析评价食品的质量特性的方法，本实验评定了添加了PPO的红茶饮料的感官特性，制得的红茶样品如图4所示。

图4 添加了PPO的红茶样品

由感官评定小组按照颜色，滋味，香气这三种进行感官评分，感官评分越高代表产品感官更趋于消费者接受，将感官评价员的最终评分进行数据统计，制成了雷达图，结果如图5所示。

图5 样品感官评分雷达图

由图5可直观看出，样品9无论颜色、滋味和香气的感官评分都是最高的，故可判断样品9对应的试验9的方案为最优工艺条件，同时验证了最佳工艺条件为：添加PPO酶的浓度为0.05%，反应温度为60℃，反应体系pH值为7。

四、结论

(1)从墨鱼墨囊中用缓冲溶液浸提所得到的多酚氧化酶PPO粗酶液，经30%-80%硫酸铵分级沉淀后其酶活性比原来提高了3.09倍，酶活性达到199450u。可见墨鱼加工废弃物墨囊中含有高活性的PPO，可用于茶饮料的加工。

(2)不同工艺参数条件下，以各样品在269nm、274nm和375nm(茶褐素269nm、茶黄素274nm、茶黄素和茶红素375nm)处测定的紫外吸收值为茶色素含量评价指标，通过单因素和正交试验，确定添加酶浓度0.05%，温度60℃和pH值为7.0是墨鱼墨PPO在红茶饮料中产生茶色素的最佳工艺条件。

(3)通过QDA分析，验证了添加酶浓度0.05%，温度60℃和pH值为7.0是墨鱼墨PPO用于红茶加工产生茶色素的最佳工艺条件，该条件下加工的红茶饮料颜色最为红艳透亮，滋味浓醇鲜爽而且涩味柔和，香气浓郁。

五、思考与展望

本研究发现，墨鱼墨囊中含有高活性的PPO，且提取纯化方法简单易行，能作为高效、经济的天然酶资源应用于茶饮料的生产加工，对推动我国茶饮料产业的发展有很大帮助。水产废弃物墨鱼墨的重新利用，达到了变废为宝的目的，为建立资源节约型和环境友好型社会做出很大贡献。经试验证明，墨鱼墨多酚氧化酶应用于红茶饮料加工中，能有效地提高茶色素特别是茶黄素的含量，不仅使红茶的感官品质、保健功效得到大大提高，也把废物利用的观念提高到了一个全新的高度，实现生态、经济和社会效益的相统一，因此墨鱼墨囊多酚氧化酶在茶饮料加工中具有广阔的应用前景。