中国汉族人群GAD1和GABRB3基因启动子区单核苷酸多态性与精神分裂症的关联研究

李 娜，安 宇，张永录，丁志杰，吴柏林，兰小平

1. 陇东学院生命科学与技术学院，庆阳 745000；2. 复旦大学人类表型组研究院，上海 201203；3. 甘肃省天水市第三人民医院精神科，天水741000；4. 复旦大学生物医学研究院，上海200032；5. 天水师范学院生物工程与技术学院，天水741000；6. 上海市儿童医院，上海交通大学附属儿童医院检验科，上海200040

精神分裂症（schizophrenia，SZ）是一类病因未明的精神类疾病，以妄想、幻想及认知障碍为典型特征，终身患病率为1%[1]，遗传度高达79%[2]。目前认为SZ具有高度遗传异质性，不同性别SZ患者的发病年龄和SZ亚型不同[3-4]。

随着分子遗传学技术的发展，已有大量研究发现γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）与 SZ的发病具有相关性。GABA是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，由脑内兴奋性神经递质谷氨酸在谷氨酸脱羧酶（glutamicacid decarboxylase，GAD）的催化下生成。研究[5-7]发现SZ患者死亡后脑组织中GABA活性水平及谷氨酸脱羧酶 67（glutamate decarboxylase 67，GAD67）亚型的mRNA的表达量下降。GAD67由位于2q31.1区的谷氨酸脱羧酶1（glutamate decarboxylase 1，GAD1）基因编码，该基因包含17个外显子。除了合成GABA的限速酶GAD1基因表达量改变引起GABA活性水平下降外，GABA受体也参与SZ的发病。γ-氨基丁酸A受体β3亚基 [γ-aminobutyric acid （GABA）Areceptor β-3，GABRB3]基因、γ-氨基丁酸 A 受体 α5亚基 [γ-aminobutyric acid（GABA）Areceptor α-5，GABRA5] 基因和 γ-氨基丁酸 A受体γ3亚基[γ-aminobutyric acid （GABA）Areceptor γ-3，GABRG3] 基因构成 γ-氨基丁酸 A 受体 [γ-aminobutyric acid （GABA）Areceptor，GABAA]的基因簇，分别编码 GABAA受体的 β3、α5和 γ3亚基。已有研究[8-10]表明GABRB3基因是SZ的易感基因。然而，以往的研究所选的相关基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位点大多数来自于基因编码区，主要关注因氨基酸序列改变导致蛋白质功能异常对SZ的影响，很少对基因非编码区SNPs位点进行研究。本文选取GAD1和GABRB3基因启动子区SNPs位点为研究对象，对中国汉族人群中GAD1基因rs3791878、rs3749034位点和GABRB3基因rs4906902位点的多态性与SZ的相关性进行分析。统计手册》（第 4 版）（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，fourth edition，DSM-Ⅳ）诊断标准明确诊断，且样本间不存在亲缘关系。624例正常个体样本（对照组）来自天水市健康志愿献血者，其中男性350名，女性274名，平均年龄（52.22±19.24）岁，所有正常个体均由2名以上精神科副主任医师确认无精神类疾病和阳性家族史，样本间不存在亲缘关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究所有对象均来源于中国汉族人群，545例SZ患者样本（病例组）来自2012年10月至2013年10月在天水市第三人民医院就诊的患者，其中男性310例，女性235例，平均年龄（37.35±12.82）岁。所有SZ患者均由2名以上精神科副主任医师参照《美国精神障碍诊断与

1.2 研究方法

1.2.1 基因选择、启动子区预测及Tag-SNPs的选择 根据已有文献报道[11-12]和蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）在线数据库STRING （http://string-db.org/）的分析结果，选择了在GABA通路中存在互作关系的GAD1和GABRB3基因作为目标基因。通过序列保守性分析预测了GAD1和GABRB3基因的启动子区域，结合1000 GENOMES数据库中的中国北京汉族人群（Han Chinese in Beijing，CHB）和中国南方汉族人群（Southern Han Chinese，CHS）（CHB+CHS=197）的 SNPs数据（dbSNP137），利用Haploview 4.2软件，以条件决定系数r2＞0.8、最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF） ＞0.05为标准进行选择，共筛选出 3个标签SNPs（Tag-SNPs），分别是位于GAD1基因启动子区的rs3791878和rs3749034位点及位于GABRB3基因启动子区的rs4906902位点。

1.2.2 样本采集及基因组DNA提取 本研究经天水市第三人民医院伦理委员会批准。受试者均由本人或监护人签署知情同意书后，采集EDTA抗凝外周静脉血3～5 mL，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN，德国）试剂盒提取基因组DNA。

1.2.3 SNaPshot基因分型 采用SNaPshot分型技术检测Tag-SNPs的多态性。在T100TMPCR 仪（Bio-Rad，美国）上 利 用 Qiagen multiplex PCR kit（100）（QIAGEN， 德国）试剂构建多重PCR反应体系，50 μL PCR反应物 包含 0.2 μmol/L PCR 引物（表 1）和 1 μL 模板 DNA，PCR反应条件为：97 ℃ 5 min，35个循环，95 ℃ 30 s，58 ℃90 s，72 ℃ 60 s，72℃ 10 min。经纯化和 SNaPshot单碱基延伸反应后，利用ABI 3130 DNA 测序仪（Applied Biosystems，美国）检测等位基因分布。SNaPshot试剂盒为 SNaPshot master mix（Applied Biosystems，美国）。应用Soft Genetics Gene Marker v 2.2.0 软件进行基因型分析。随机抽取 10%的样本使用 ABI 3130 DNA 测序仪进行双向Sanger测序验证，基因分型一致率为100%。

表1 SNaPshot分型引物Tab 1 Primers for SNaPshot genotyping

1.3 统计学分析

使用 R64 3.5.3 软件分析病例组与对照组间年龄和性别的差异，年龄分析采用两独立样本t检验、性别分析采用χ2检验。应用SNPstats（https://www.snpstats.net/snpstats/start.htm）在线软件进行哈迪 - 温伯格平衡 （Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE） 检验、等位基因和不同遗传模式下基因型分布分析。采用Kaplan-Meier统计分析检验rs3791878位点风险基因型G/T与男性SZ患者发病年龄的相关性。样本量统计效能检验使用Quanto 1.2.4软件计算。所有检验均为双侧检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般人口学资料

病例组共545例，男性310例（56.9%），女性235例（43.1%），年龄14～76岁，平均年龄（37.35±12.82）岁。对照组共624例，男性350例（56.1%），女性274例（43.9%），年龄19～88岁，平均年龄（52.22±19.24）岁。病例组与对照组相比，性别构成差异无统计学意义（P=0.831），年龄差异有统计学意义（P=0.000）。

2.2 统计效能检验

Tag-SNPs中rs3749034 的MAF最小（MAF=0.233）。假设OR=1.5，加性模式，疾病一般人群患病率为1%[1]，根据Quanto1.2.4软件计算，结果显示统计效能为0.99。

2.3 Tag-SNPs等位基因分布比较

对照组中3个Tag-SNPs位点基因型分布符合HWE检验。由于样本损失，有18例样本的rs3791878位点数据缺失，12例样本的rs3749034位点数据缺失，3例样本的rs4906902位点数据缺失。分别在总体样本和性别分层后样本的病例组与对照组之间对3个Tag-SNPs位点的等位基因分布进行分析。结果显示：总体样本病例组与对照组相比，3个Tag-SNPs位点等位基因分布差异均无统计学意义（P＞0.05）（表2）；男性病例组与对照组相比，rs3791878位点等位基因分布差异有统计学意义（P=0.039），P值经 Bonferroni校正后，差异无统计学意义（P=0.117）；女性病例组与对照组相比，3个Tag-SNPs位点等位基因分布差异均无统计学意义（P＞0.05）（表 3）。

表2 病例组与对照组Tag-SNPs 等位基因分布的比较Tab 2 Comparison of allele distribution of Tag-SNPs between case group and control group

表3 病例组与对照组Tag-SNPs等位基因分布的比较（按性别分层）Tab 3 Comparison of allele distribution of Tag-SNPs between case group and control group （stratified by sex）

2.4 Tag-SNPs基因型分布比较

分别在共显性（co-dominant）、显性（dominant）、隐性（recessive）、超显性（over-dominant）和加性化（logadditive）5种不同的遗传模式下对3个Tag-SNPs位点基因型分布进行分析。结果显示，总体样本的病例组与对照组相比，rs3791878位点在共显性、显性和超显性遗传模式下基因型分布差异均有统计学意义（P=0.022，P=0.011，P=0.006）。挑选赤池信息准则（Akaike Information Criterion，AIC）和贝叶斯信息准则（Bayesian Information Criterion，BIC）数值最小的超显性遗传模式为rs3791878位点可能的遗传模型，该模型下的P值经Bonferroni 校正后，差异仍有统计学意义（P=0.018）。而rs3749034位点和rs4906902位点在5种不同遗传模式下基因型分布差异均无统计学意义（P＞0.05）（表4）。在性别分层后样本的病例组与对照组之间对rs3791878位点的基因型分布进行分析，结果显示：男性病例组与对照组相比，rs3791878位点在超显性遗传模式下基因型分布差异有统计学意义（P=0.000），P值经Bonferroni 校正后，差异仍有统计学意义（P=0.000）；女性病例组与对照组相比，rs3791878位点在5种不同遗传模式下基因型分布差异均无统计学意义（P＞0.05）（表 5）。

表4 病例组与对照组 Tag-SNPs 不同遗传模式下基因型分布的比较Tab 4 Comparison of genotype distribution of Tag-SNPs under different genetic models between case group and control group

Continued Tab

表5 病例组与对照组rs3791878位点不同遗传模式下基因型分布的比较（按性别分层）Tab 5 Comparison of rs3791878 genotype distribution under different genetic models between case group and control group (stratified by sex)

Continued Tab

2.5 rs 3791878 位点风险基因型G/T与男性SZ发病年龄的相关性

310例男性SZ患者共有195例记录了首次发病年龄，应用Kaplan-Meier分析rs3791878位点风险基因型G/T与195例男性患者发病年龄的相关性，结果表明G/T基因型与男性SZ的发病年龄无相关性（χ2=0.271，P=0.603）（图 1）。

图1 rs3791878位点风险基因型G/T与男性SZ发病年龄的相关性Fig 1 Correlation between the risk genotype G/T of rs3791878 and the age of onset in male SZ

3 讨论

本研究选择GABA通路相关基因启动子区SNPs为研究对象，探索GAD1基因rs3791878和rs3749034位点、GABRB3基因 rs4906902位点多态性与SZ的相关性。PPI分析显示GAD1和GABRB3存在相互作用，且均与溶质载体家族蛋白32成员A1（solute carrier family 32 member 1，SLC32A1）和突触关联蛋白25（synaptosomalassociated protein 25，SNAP25）有直接联系；SLC32A1和SNAP25为GABA通路相关蛋白且与SZ发病相关[13-14]。关联分析结果表明，rs3791878位点在超显性遗传模式下，G/T基因型会增加男性SZ的发病风险，且风险达1.91，但没有得到G/T基因型提前男性SZ患者发病年龄的结果。由于本研究样本量所限，这一结果还需要进一步在更大样本量群体中进行验证。本研究没有发现rs3749034、rs4906902位点与SZ存在相关性。

Du等[15]在2008年对235个中国汉族SZ家系的研究结果也表明GAD1基因rs3791878位点与男性SZ的发生相关。结合本研究，我们认为rs3791878位点存在偏从性显性遗传的可能性，其杂合子的表达受到性别影响，从而增加SZ的发病风险。rs3791878位点在超显性遗传模式下与SZ显著相关，其原因一方面可能与G/T基因型对转录起始因子与启动子序列结合能力的改变有关，最终导致该基因表达量的改变；另一方面可能是G/T会启动不同的蛋白质或不同亚基的表达，导致谷氨酸脱羧酶GAD67亚型活性发生改变，促进SZ的发生。

Straub等[16]认为rs3749034位点突变会导致GAD1基因启动子区产生锌指结构转录因子[ATP1A1 （Na+, K+ATPase α-1 subunit） regulatory element binding factor 6，AREB6］ 和成肌分化抗原（myogenic differentiation antigen，MYOD）的结合位点，这2种转录因子能够影响GAD67mRNA的表达。但本次研究没有发现该位点与SZ的相关性。这一结果与Addington等[17]发现rs3749034位点参与SZ早期发病的结果不一致。也有研究[18]发现儿茶酚-O-甲基转移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT） 基 因 Val158Met（rs4680）位点与rs3749034位点的相互作用会导致左侧海马旁回皮质的厚度减少，且只有COMTVal158Met突变位点携带者才表现出rs3749034位点变异的阳性结果。这说明该位点可能参与SZ的发生，但并非主导因素。

Urak等[19]认为rs4906902位点的等位基因A突变为G会改变神经元特异性转录激活剂N-Oct-3的结合活性。rs4906902位点与rs8179184位点紧密连锁，单倍型G-T频率在SZ患者组的分布显著高于对照组[20]，但本研究没有发现rs4906902位点与SZ的相关性，这可能是因为SZ的异质性所导致的。

本研究结果虽然表明rs3791878位点G/T基因型能够显著增加中国汉族男性人群SZ的发病风险，同时提示GAD1基因是中国汉族男性人群SZ的易感基因，但未涉及机制方面的研究工作。今后仍需大样本研究进一步明确GAD1基因与SZ发生的相关性并开展相关的功能研究，以揭示其致病机制。