捏法对大鼠至阳穴皮肤内源性大麻素受体的影响

吴倩雯，余文英，黄 华，黄明愉，林丽莉

（福建中医药大学针灸学院，福建 福州350122）

捏法是以捏、捻、提等复合式手法为主，将脊骨处皮肤提起捻动的操作手法，源于捏脊手法，是一种对局部皮肤的机械力刺激。 内源性大麻素系统（endogenous cannabinoid system，ECS）由大麻素受体、内源性大麻素及其合成和降解的酶组成［1］，在表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌层均有分布［2－3］，参与调节皮肤免疫［4］、炎性反应及损伤修复［2－3］，其中，大麻素受体主要包括内源性大麻素受体1（CB1）和内源性大麻素受体2（CB2）［1］。 研究表明：皮肤中的CB1 和CB2 可 能 参 与 抗 炎［5］及 皮 肤 损 伤 修 复［2］，CB2 还 与镇痛效应有关，阻断CB2 可使电针镇痛效应减弱［6］。有人以系统评价的方法发现按摩能够激活ECS［7］。捏法作为一种按摩手法，对于ECS 的影响尚不明确，因此，我们采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测方法，观察不同强度的捏法刺激对CB1 和CB2 的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠24 只由福建中医药大学实验动物中心提供，6～7 周龄，体质量（200±20） g，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。 实验环境符合国家实验动物饲养和使用指南，室温保持在（22±2）℃，光／暗周期为12／12 h，动物自由取食和饮水。

1.2 主要试剂和仪器 RIPA 裂解液（强）、PMSF、BCA 定量试剂盒、超敏ECL 化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；CB1 一抗、β-actin 一抗（武汉三鹰有限公司）；CB2 一抗（武汉澳波泰克生物科技有限公司）；HRP 鼠抗兔IGg 二抗（南京诺维赞生物科技有限公司）；Stripping Buffer 洗脱液、ST 16R 高速冷冻离心机（美国Thermo 公司）；Infinite M200 PRO 全自动酶标仪（瑞士TECAN 公司）；ChemiDoc XRS＋化学发光成像分析系统（美国Bio-Rad 公司）。

2 实验方法

2.1 分组 24 只大鼠编号后按照随机数字表分为空白组、轻刺激组、中刺激组、重刺激组，每组各6 只。

2.2 干预方法 适应性喂养1 周后，空白组大鼠仅模拟抓取动作，不做任何治疗；轻、中、重刺激组于至阳穴分别给予捏法7、14、21 次，每天1 次，每周刺激5 d，休息2 d，连续3 周。 至阳穴位于背中线第7、第8 胸椎棘突间，参照于曙光主编《实验针灸学》［8］附录图选取。 捏法的具体操作：以左手固定大鼠及局部棘突，右手拇指伸直，以拇指与食指、中指螺纹面将皮肤捏起， 力度以大鼠不尖叫为度， 约2下／s 的频率进行捏捻。 捏脊由同一人操作，实验前进行手法培训，严格按照要求操作。

2.3 至阳穴皮肤取材 干预3 周后取材。 各组大鼠麻醉后，局部脱毛，取各组大鼠至阳穴部位包含真皮乳头层、真皮网织层、皮下组织层的皮肤，体积约0.7 cm×0.7 cm×0.5 cm，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。

2.4 皮肤内源性大麻素受体含量检测 取样后液氮下研磨，以组织（g）∶裂解液（μL）＝1∶50 的比例加入组织裂解液，冰上超声研磨后，4℃，14 000 r／min离心15 min，取上清液，BCA 法定量。 进行Western blot 检测： ①取13 μL 定量后样品， 用10% SDSPAGE 凝胶电泳分离后，半干转至PVDF 膜。 ②转膜后将PVDF 膜用脱脂奶粉室温下封闭2 h，TBST洗涤8 min；放入一抗中4 ℃摇床过夜后，TBST 洗涤3 次，每次5 min；放入二抗中常温1 h，TBST 洗涤3 次后显影；以β-actin 为内参，显影后Stripping Buffer 洗脱液洗脱后重新封闭，加入β-actin 一抗，重复上述流程。③超敏ECL 化学发光试剂盒显影，按照试剂盒说明书配置显影液， 采用ChemiDoc XRS+化学发光成像分析系统进行图像采集及处理，通过光密度计算指标与内参的体积比值，即为蛋白相对表达量。

2.5 统计学方法 采用SPSS 22．0 统计软件进行数据处理。 计量资料符合正态分布的以（±s）表示，两两比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。

3 结 果

4 组至阳穴皮肤CB1、CB2 蛋白相对表达量见图1、图2 及表1。

图1 4 组至阳穴皮肤CB1 蛋白相对表达量

图2 4 组至阳穴皮肤CB2 蛋白相对表达量

表1 4 组至阳穴皮肤CB1、CB2 蛋白相对表达量（±s）

表1 4 组至阳穴皮肤CB1、CB2 蛋白相对表达量（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.01，2） P＜0.05；与重刺激组比较，3） P＜0.01。

CB2 0.33±0.13 0.64±0.232）0.67±0.182）0.56±0.15组别空 白 组轻刺激组中刺激组重刺激组n 6 6 6 6 CB1 0.53±0.09 0.49±0.143）0.53±0.093）0.78±0.121）

4 讨 论

捏脊常用于儿童保健，具有提高免疫力、促进生长发育的作用。 有研究者认为诸多传统体表刺激如针灸、整脊、按摩等方法对神经发育及神经保护作用的效应，很有可能是依赖内源性大麻素系统介导实现的［9］。 本实验中，在予以3 周的捏法后，大鼠皮肤内源性大麻素受体表达发生了改变。 皮肤是人体最大的免疫器官，在许多人和鼠的细胞群如皮肤神经纤维、肥大细胞、表皮角质形成细胞和附属组织细胞中，可观察到CB1 和CB2 的免疫反应［4］，手法及针刺治疗都能够对其产生影响［9－10］。 捏法作为一种治疗手法，能够对皮肤产生机械力刺激。 通过对至阳穴大麻素受体蛋白表达的检测发现：不同刺激量的捏法对于内源性大麻素系统的效应是不同的，且以中刺激和重刺激效果更为显著，说明这种体表刺激的方式需要达到一定刺激量才能够发挥作用。

但激活不同受体所需的刺激量有所不同。 由于分布的不同，CB1 与突触可塑性更为相关，CB2 与免疫反应更有关联，因此不同强度的手法刺激影响的效应有所不同。 CB2 功能的发挥更大程度上受外部刺激的影响［11］，较轻的捏法刺激就能对其产生影响。 至者，达也，又极也；阳中之阳，阳之至也曰“至阳”，至阳穴位于背部阴阳交关处［12］。刺激至阳穴能够使CB2 表达增多而调动ECS 系统， 影响人体免疫反应。 皮肤中表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌层是两种受体共同存在的区域，不同的是，CB2 在血管平滑肌、神经纤维外膜及神经纤维束束膜也有分布［3］，因此，CB2 激活所需的刺激强度较小或许与其更广泛的分布有关。 其次，外周内源性大麻素参与抗痛觉过敏，其作用主要通过CB1 来实现［13］，重刺激引起的CB1 表达增多可能与疼痛有关。重刺激干预下，CB1表达增多，CB2 增多不显著，这或许是由于此时内源性大麻素系统的作用更倾向于抗疼痛。 捏脊手法临床上既应用于保健，也应用于治疗，在脑瘫患儿的治疗中亦有应用。 若仅为了提高免疫力，手法刺激应更加轻柔；若为了治疗脑瘫等疾病，则应采用相对更强的刺激，这与临床实际是相符合的。

本实验结果显示：①一定刺激量的捏法刺激能够激活ECS 系统，从而增强皮肤的抗炎与修复能力，这或许是捏脊手法起效的可能机制之一；②重刺激强度的捏法能够使至阳穴皮肤CB1 表达增多，轻刺激与中刺激强度的捏法能够使至阳穴皮肤CB2 表达增多，一定强度的捏法刺激可能提高皮肤修复及抗炎能力。

本实验仅采用普通大鼠进行实验，尚未引入病理模型，选穴和手法也比较单一。 手法治疗如何通过ECS 系统对疾病产生作用，仍需要进一步研究。