半枝莲对人结肠癌细胞SW620 增殖和凋亡的影响

黄雅娜，张 铃，林 炜

（福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122）

结直肠癌是全球排名第三的癌症且死亡率居第四位［1］，目前临床上治疗结肠癌主要以手术切除为主，辅以放疗、化疗和靶向药治疗等。 近年来，中医药在治疗结肠癌上取得了一定的进展，其着重于减轻化疗的毒副作用，改善癌症患者生存质量。 半枝莲是临床上常用于治疗结肠癌的中药，其性味辛、苦、寒，归肺、肝、肾经，具有清热解毒、化瘀利尿、消肿止痛等功效。 据《中国药典》记载，半枝莲常单用或联合应用在肺癌、 乳腺癌和结直肠癌等肿瘤的治疗，并取得了较好疗效［2-4］。 本研究通过体外细胞实验探讨半枝莲对人结肠癌SW620 细胞的增殖和凋亡的影响。

1 材 料

1.1 细胞株 人结肠癌细胞株SW620 购自上海中国科学院细胞库。

1.2 药物提取 取半枝莲全草，粉碎后用85%乙醇回流提取3 次，合并提取液，压浓缩至无醇味，加水混悬后，用氯仿进行萃取，即可得到半枝莲氯仿极性部位提取物（ECSB），后用旋转蒸发仪蒸干待用。

1.3 试剂 RPMI-1640 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；PBS 缓冲液、双抗（青霉素和链霉素）购自美国Hyclone 公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、SDS-PAGE 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；DAPI 染色液、BCA试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）；PCNA、Survivin、GAPDH 一抗、HRP 二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；PVDF 膜（美国GE 公司）。

1.4 仪器 CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；荧光显微镜（德国Leica 公司）；Infinite 200 PRO 多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司）；垂直电泳槽、ChemiDocXRS+化学发光成像系统（美国Bio-Rad 公司）。

2 方 法

2.1 ECSB 制备 称取200 mg ECSB 溶于1 mL DMSO，制备成200 mg／mL 母液，4 ℃保存，干预细胞时用RPMI-1640 完全培养基配置成所需浓度。

2.2 细胞培养及干预 SW620 细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI-1640 培养基于37 ℃、5%CO2条件下培养；当细胞汇合到80%左右后，用0.25%胰酶消化并传代，用于后续实验。 实验分组：0 μg／mL 组、12.5 μg／mL 组、25 μg／mL 组、50 μg／mL 组、75 μg／mL 组。

2.3 MTT 法检测细胞活力 取对数生长期细胞按1.0×105个／mL 的密度接种于96 孔板，每孔100 μL；细胞贴壁后，加入0、12.5、25、50、75 μg／mL 的ECSB干预SW620 细胞24 h；24 h 后去除上清液， 加入100 μL MTT 于37 ℃孵育4 h；4 h 后去除MTT，再加入100 μL DMSO，用Infinite 200 PRO 多功能酶标仪在490 nm 处检测OD 值。 按照以下公式计算细胞活力：（实验组OD 值／对照组OD 值）×100%。

2.4 DAPI 染色检测细胞凋亡 取对数期生长细胞，按照1×105个／mL 细胞密度接种于6 孔板中，每孔2 mL；加入0、25、50、75 μg／mL 的ECSB 干预SW620 细胞24 h 后，用PBS 洗涤3 次；用4%多聚甲醛固定细胞5 min，每孔加入2 μg／mL DAPI 500 μL，37 ℃避光15 min，用PBS 清洗3 次。 倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

2.5 流式细胞术检测细胞周期 取对数期生长细胞， 按照1×105个／mL 细胞密度接种于6 孔板中，每孔2 mL；加入0、50 μg／mL 的ECSB 干预SW620细胞24 h 和48 h 后， 弃去上清后，PBS 洗涤1 次；分别加入预冷的75%酒精固定4 h，PBS 洗涤3 次后加入500 μL PI，4 ℃避光染色30 min。 流式细胞仪检测细胞周期。

2.6 蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞中PCNA、Survivin 蛋白的表达情况 取对数期生长细胞，按照1×105个／mL 细胞密度接种于6 孔板中，每孔2 mL；加入0、25、50、75 μg／mL 的ECSB 干预SW620 细胞24 h 后，用PBS 洗涤1 次；收集细胞后加入蛋白裂解液，涡旋4 次，每次静置5 min，后12 000 rpm／min 离心20 min，吸取上清液即为所收集的蛋白样品。 用BCA 法进行蛋白定量，后加入5×SDS上样缓冲液，95 ℃金属浴变性5～10 min。以50 μg 上样量进行垂直电泳跑胶，电压条件为：浓缩胶80 V，30 min；分离胶120 V，55 min。 用PVDF 膜进行转膜，转膜条件为110 V，60 min。 转膜后，用5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，封闭后用PCNA（1∶1 000）和Survivin（1∶1 000）的一抗4 ℃摇床孵育过夜，TBST 洗3 次，5 min／次； 用HRP 二抗（Rabbit，1∶10 000）室 温 孵 育1 h，TBST 洗3 次，5 min／次。 最后用ECL 试剂显影成像。

2.7 统计学处理 采用SPSS 22.0 软件进行数据分析。 计量资料属正态分布的以（±s）表示，采用t检验和单因素方差分析，非正态分布的采用秩和检验；计数资料采用χ2检验。

3 结 果

3.1 4 组抑制SW620 细胞活力比较 MTT 结果表明不同浓度（12.5、25、50、75 μg／mL）的ECSB 可显著抑制结肠癌细胞SW620 的活力，并呈现明显的剂量依赖，见表1。

表1 4 组抑制SW620 细胞活力比较（±s）

表1 4 组抑制SW620 细胞活力比较（±s）

注：与0 μg／mL 组比较，1） P＜0.01。

组别0 μg／mL 组12.5 μg／mL 组25 μg／mL 组50 μg／mL 组75 μg／mL 组细胞活力／%100.0±2.0 89.0±1.01）58.5±1.11）43.4±0.51）38.2±0.31）n 6 6 6 6 6

3.2 4 组对SW620 细胞凋亡和增殖影响的比较不同浓度（25、50、75 μg／mL）ECSB 处理SW620 细胞24 h 后，对细胞进行DAPI 染色，结果显示：在ECSB 干预后出现了细胞核固缩，核碎裂，说明ECSB能促进SW620 细胞的凋亡，见图1（箭头所示）、表2。利用流式技术检测细胞周期，结果显示：用50 μg／mL ECSB 处理SW620 细胞24 h 后，其S 期与对照组无显著性差异（P＞0.05），而进一步干预48 h 后，其S 期出现明显的阻滞，说明ECSB 能抑制SW620细胞的增殖，见表3。

图1 4 组SW620 细胞凋亡情况（×40）

表2 4 组促进SW620 细胞凋亡比较（±s）

表2 4 组促进SW620 细胞凋亡比较（±s）

注：与0 μg／mL 组比较，1） P＜0.01。

组别0 μg／mL 组25 μg／mL 组50 μg／mL 组75 μg／mL 组凋亡率／%2.7±0.1 6.5±0.71）9.5±1.21）31.8±1.41）n 3 3 3 3

表3 2 组抑制SW620 细胞增殖比较（±s）

表3 2 组抑制SW620 细胞增殖比较（±s）

注：与0 μg／mL 组比较，1） P＜0.05。

组别0 μg／mL 组50 μg／mL 组细胞S 期／%24 h 23.8±0.8 29.1±1.7 48 h 22.8±1.3 33.2±2.31）

3.3 4 组SW620 细胞中PCNA 和Survivin 表达不同浓度（25、50、75 μg／mL）ECSB 处理SW620 细胞24 h 后，检测细胞中PCNA 和Survivin 的表达，结果显示：与0 μg／mL 组比较，75 μg／mL 的ECSB能明显降低Survivin 和PCNA 的表达（P 均＜0.05），见图2、图3、图4。

4 讨 论

结直肠癌属中医“锁肛痔”“积聚”“肠覃”“肠癖”等范畴。 中医认为结直肠癌病机为本虚标实，治疗上以清热解毒，活血化瘀为治疗原则［5］。 中医治疗肿瘤的临床用药和实验研究中，有60%以上的中药为清热解毒类药物［6］。半枝莲属唇形科多年生草本，归属清热解毒类中药，现代研究表明：半枝莲中多种有效活性化学成分具有良好的抗肿瘤活性，对治疗肺癌、乳癌、肝癌、胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤疗效显著［7］。

图2 4 组SW620 细胞PCNA 和Survivin 蛋白表达电泳图

图3 4 组对SW620 细胞PCNA 蛋白表达比较

图4 4 组SW620 细胞Survivin 蛋白表达比较

中药治疗肿瘤有两个方面药理机制：一是抑制肿瘤细胞的生长、增殖，从而阻止肿瘤的增大和扩散；二是促进肿瘤细胞凋亡坏死，进而使肿瘤组织缩小、消退。 本研究通过DAPI 染色和流式细胞术实验证明：25、50、75 μg／mL 的ECSB 干预结肠癌细胞SW620 后呈现出较高的凋亡率，提示ECSB 抑制细胞增殖可能通过诱导细胞凋亡导致，从而达到抗肿瘤效果［8-9］。

细胞周期调控异常引起肿瘤细胞增殖失控是恶性肿瘤基本的生物学特征［10］。 PCNA 为增殖细胞核抗原， 其表达水平与肿瘤细胞增殖呈正相关，已成为反映细胞增殖的标记物之一。 Lin Wei 等［11］通过建立小鼠结肠癌皮下移植瘤模型，发现夏枯草可以通过显著抑制PCNA 的表达，从而起到促进结直肠癌细胞凋亡，抑制细胞增殖。 细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的程序性死亡，可以维持机体的正常运转，而在肿瘤细胞中，其细胞凋亡调控机制失常［12］。Survivin 是凋亡抑制基因家族的成员之一，具有抑制细胞死亡和控制有丝分裂的功能。 Survivin在大多数健康成人组织中检测不到，而几乎在所有人类肿瘤中均显著表达。 在结肠直肠癌患者中，Survivin 的高表达与不良预后、生存期缩短以及体内肿瘤细胞凋亡减少有关［13］。 Yujiro Fujie 等 认为Survivin 是细胞凋亡和有丝分裂突变的关键分子，奥沙利铂能有效抑制Survivin，与某些化学试剂联合使用时，可通过促进细胞凋亡和有丝分裂突变而发挥明显的作用［14］。本研究发现：ECSB 可能是通过下调SW620 细胞的Survivin 促进SW620 细胞的凋亡，通过下调PCNA 来抑制细胞的增殖，从而最终显著抑制SW620 细胞的活力。

本研究探讨半枝莲对肿瘤细胞增殖、凋亡方面的影响，为其临床治疗结直肠癌提供科学依据。 但肿瘤细胞的增殖和凋亡受到众多机制的复杂调控，半枝莲对人结肠癌细胞的增殖及凋亡是否涉及其他信号通路，有待进一步研究探讨。