临床抗菌药对兔源沙门氏菌的体外抑菌效果
2020-04-13明月月吴群牛金利丁月霞
明月月 吴群 牛金利 丁月霞
摘要 为了解临床常用抗菌药对兔源沙门氏菌的体外抑菌效果，采用微量肉汤二倍稀释法测定临床常用8种抗菌药物对病原菌的最小抑菌浓度（MIC），采用棋盘稀释法进行体外联合药敏试验测定病原菌部分的抑菌浓度指数（FIC）。结果表明，分离鉴定病原菌为沙门氏菌，庆大霉素的抑菌效果最强（0.125 μg/mL），其次为氧氟沙星（0.250 μg/mL）、恩诺沙星（0.500 μg/mL），磺胺嘧啶钠（8.000 μg/mL）、磺胺间甲氧嘧啶与阿米卡星（均为16.000 μg/mL）抑菌效果较差，而阿莫西林与青霉素的抑菌效果最差（均为128.000 μg/mL）。联合药敏试验结果表明，阿莫西林与氧氟沙星、庆大霉素与氧氟沙星联用呈协同作用，阿米卡星与磺胺嘧啶钠、阿米卡星与磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星与阿米卡星联用呈无关作用，氧氟沙星与磺胺间甲氧嘧啶、青霉素与阿米卡星、庆大霉素与磺胺嘧啶钠联用呈拮抗作用。
关键词 兔源沙门氏菌，抗菌药，最小抑菌浓度（MIC），聯合药敏试验
中图分类号 S855.1文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2020）06-0074-03
Abstract In order to understand antimicrobial effect of the clinical commonly used antimicrobial agents on salmonella from rabbit in vitro，we used eight kinds of antimicrobial drugs against pathogens to investigate the minimum inhibitory concentration （MIC） of the clinical commonly，and the fractional inhibitory concentration （FIC index） of some antimicrobial agents against pathogens was determined by the chessboard dilution method of microbroth.The results showed that the isolated and identified pathogenic was Salmonella sp..And antibacterial drugs of gentamicin performed well with MIC of 0.125 μg/mL， followed by xfloxacin （0.250 μg/mL） and enrofloxacin（0.500 μg/mL），the sulfadiazine sodium（8.000 μg/mL），sulfamonomethoxine and amikacin（both 16.000 μg/mL） have even lower antimicrobial effect， amoxicillin and penicillin showed the worst antimicrobial effect，with MIC both of 128.000 μg/mL.By combining with drug sensitive test results，the combination of amoxicillin and ofloxacin，gentamicin and ofloxacin showed a synergy effect.But the combination of amikacin and sulfadiazine sodium，amikacin and sulfamonomethoxine，enrofloxacin and amikacin showed no correlation.Penicillin and amikacin，gentamicin and sulfadiazine sodium had a combination role in antagonism.The combination of xfloxacin and sulfamonomethoxine，penicillin and amikacin，gentamicin and sulfadiazine sodium showed antagonism.
Key words Salmonella from rabbit，Antibiotics，Minimum inhibitory concentration （MIC），Combined drug sensitiveness test
沙门氏菌是肠杆菌科中最常见的病原菌之一，为两端钝圆、无荚膜、无芽孢、周身鞭毛、大部分都具有菌毛的革兰氏阴性胞内寄生短肠杆菌[1]。沙门氏菌在自然界中广泛分布，至今已检测出血清型2 500余种，我国已有292个血清型的报道[2]，能引起畜禽、犬猫等多种动物感染疾病，也可导致人类食物中毒，具有广泛的致病性[3]。据调查，我国由沙门氏菌引起的食源性疾病占70%～80%，有相当一部分人感染沙门氏菌与食用沙门氏菌污染的动物性食品有关[4]。兔副伤寒病，即兔沙门氏菌病，是由鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌这两种病原菌引起的兔消化道疾病。虽然兔子不是沙门氏菌的主要宿主，且关于家兔感染沙门氏菌的报道较少，但我国是世界上兔肉生产和出口大国[5]，兔肉品质、卫生以及安全显得格外重要。在实际生产中，沙门氏菌病可用抗生素治疗，但不合理使用会产生耐药性[6]等问题。如今耐药菌株的不断出现，曾经高效的抗菌药现已逐渐落下帷幕，而合理的联合用药可扩大抗菌谱，增强疗效减少用量，延缓或降低耐药性的产生。为减少生产中沙门氏菌所带来的经济损失，如何有效合理利用抗菌药控制沙门氏菌成为当前讨论的热点。笔者通过微量肉汤二倍稀释法测定8种抗生素对分离鉴定的兔源沙门氏菌的MIC值，采用棋盘稀释法进行体外联合药敏试验，测定其对兔源沙门氏菌的部分抑菌浓度指数（FIC），旨在为临床上更有效地联合使用抗菌药物，防治沙门氏菌病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与药物。菌株由广东海洋大学动物医院就诊病例垂耳兔肛门拭子分离。
恩诺沙星（批号为170524），购自广东海康兽药有限公司，磺胺间甲氧嘧啶磺胺（批号为20180120）、磺胺嘧啶钠（批号为20180210）均购自上海骑骠动物保健品有限公司，阿米卡星（批号为180101）和庆大霉素（批号为180170）购自海南海灵化学制药有限公司，阿莫西林（批号为20131108），购自四川鼎尖动物药业有限责任公司，青霉素（批号为131105），购自华北制药股份有限公司，氧氟沙星（批号为20150213），购自鹤山市南华动物药业有限公司。
1.1.2 主要试剂与仪器。
营养肉汤和营养琼脂，均购自北京陆桥技术有限责任公司，革兰氏染色液和麦康凯琼脂均购自广东环凯微生物科技有限公司，细菌微量生化鉴定盒购自杭州濱和微生物试剂有限公司，干燥箱、生化培养箱、压力蒸汽灭菌器、博迅蒸馏水器、电子分析天平、超净工作台等主要仪器。
1.2 方法
1.2.1 药液的制备。
用无菌生理盐水配制抗生素药液，初始浓度为1 280 μg/mL （磺胺类抗生素为2 560 μg/mL），溶解后置于4 ℃下保存备用。
1.2.2 致病菌鉴定及菌液制备。
将病料接种于灭菌营养肉汤中37 ℃下培养24 h后，在营养琼脂平板上划线37 ℃下培养24 h，挑单个菌落于麦康凯琼脂平板培养基上37 ℃下培养24 h，挑取透明或半透明的白色单个菌落革兰氏染色并镜检，观察其形态特征，并与沙门氏菌形态特征进行对比。挑选疑似菌株，活化后取20 μL菌液加入微量生化管中封闭。在相应温度培养24～48 h后，观察培养结果并对照《肠杆菌科细菌生化鉴定编码册》确定菌株菌属。无菌挑取已分离鉴定的单个菌落于营养肉汤中37 ℃下培养24 h后，在营养琼脂平板上划线37 ℃下培养24 h，挑取单个菌落接种于2 mL营养肉汤中，37 ℃下培养24 h后，吸取0.5 mL菌液，将菌液用肉汤按0.1倍梯度稀释至细菌含量为1×105 CFU/mL（与0.5麦氏比浊管的浑浊度对比），备用。
1.2.3 单药MIC测定与结果判定。
采用微量肉汤法二倍稀释法，在96孔板上添加供试菌液：第1列均添加180 μL，其余各孔均添加100 μL至第11孔，第12孔作为空白对照（即阴性对照）。取20 μL对应供试药物分别加入相应药物的1号孔，用移液枪吹吸混匀后吸出100 μL加至2号孔，同理按顺序稀释至11号孔，弃去100 μL。1～12号孔的药物含量依次为128.000、64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0 μg/mL。每种药物进行2组平行对照。稀释结束将96孔板置于生化恒温箱37 ℃培养24 h后观察结果。结果判断标准如下：孔内肉汤呈明显混浊判为阳性，肉汤呈清亮无菌生长的最低浓度即为最小抑菌浓度。
1.2.4 联合药敏试验测FIC指数与结果判定。
采用棋盘稀释法进行体外联合药敏试验，测定FIC指数，以单药对供试菌MIC值为中心浓度，对其16.00倍、8.00倍、4.00倍、2.00倍、1.00倍、0.50倍、0.25倍浓度分别进行联合，并设置甲药、乙药的单药对照及菌液阳性对照和肉汤阴性对照。采用二倍稀释法制备A、B抗生素菌药液，在试管架上摆2排7支试管，第1排稀释A抗生素、第2排稀释B抗生素。将第1排每个试管中分别加入2 mL标准菌液后，在第1管加入2 mL 32.00 MIC 的A药液，混匀后吸取2 mL到第2管，依次稀释至第7管，最后1管弃去2 mL，按上述方法所得1～7号孔的A药物浓度依次为16.00 MIC、8.00 MIC、4.00 MIC、2.00 MIC、1.00 MIC、0.50 MIC、0.25 MIC。按此方法配制B抗生素菌药液。在96孔板上，将1～7号A菌药液管分别依次加入100 μL于1～7排的前8个孔，将1～7号B菌药液管分别依次加100 μL于1～7列的前8个孔，其第8排作为B药单药对照，第8列作为A药单药对照，第8排的第8列孔中加200 μL菌液作为阳性对照，试验设置阴性对照。结果判断如下：底部对光观察，肉汤浑浊为阳性，否则为阴性，以FIC值为判断依据：FIC=甲药单药MIC/甲药单药MIC+乙药单药MIC/乙药单药MIC，若FIC≤0.5，则为协同作用，若0.5
2 结果与分析
2.1 致病菌鉴定
2.1.1 菌落形态观察。在麦康凯琼脂平板上，菌落呈白色凸起，边缘圆润。挑单个菌落革兰氏染色并镜检，呈现红色短杆菌。
2.1.2 微量生化管鉴定。将生化鉴定结果对照《肠杆菌科细菌生化鉴定编码册》进行编码，得出编码结果为611，见表1，结果显示该菌种为沙门氏菌。
2.2 单药最小抑菌浓度（MIC）
由表2可知，庆大霉素的抑菌效果最强（0.125 μg/mL），而氧氟沙星（0.250 μg/mL）、恩诺沙星（0.500 μg/mL）、磺胺嘧啶钠（8.000 μg/mL）、磺胺间甲氧嘧啶与阿米卡星（均为16.000 μg/mL）抑菌效果较差，而阿莫西林与青霉素的抑菌效果最差（均为128.000 μg/mL）。
2.3 2种抗生素的体外联合药敏试验结果
由表3可知，阿莫西林+氧氟沙星、庆大霉素+氧氟沙星呈协同作用，FIC指数均大于等于0.5，阿米卡星+磺胺嘧啶钠、阿米卡星+磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星+阿米卡星呈无关作用，FIC指数均介于1.0～2.0（含2.0），氧氟沙星+磺胺间甲氧嘧啶、青霉素+阿米卡星、庆大霉素+磺胺嘧啶钠呈拮抗作用，FIC指数大于2.0。
3 讨论
3.1 单药最小抑菌浓度（MIC）
该试验结果表明，各药物的抑菌效果从大到小依次为庆大霉素、氧氟沙星、恩诺沙星、磺胺嘧啶钠、磺胺间甲氧嘧啶、阿米卡星、阿莫西林、青霉素，8种抗生素对分离菌株产生抑菌作用的程度差异可能是因为不同类抗生素作用机制不同[7]、抑菌作用范围或菌株耐药程度不同。
庆大霉素与阿米卡星为氨基糖苷类抗生素（AGs），属于广谱高效杀菌性抗生素，对需氧G-杆菌抑菌效果好，对G+效果较差，对厌氧菌无效。AGs作用机制[8]是抑制细菌蛋白质合成，迄今仍对革兰氏阴性菌感染起到良好效果，并在临床生产中广泛使用。刘振波等[9]试验结果表明，庆大霉素对创伤弧菌敏感性强。牛江婷等[10]研究表明庆大霉素对兔支气管败血波氏杆菌有较强抑菌作用，并与该研究中庆大霉素的抑菌效果相符，阿米卡星效果比庆大霉素的效果差，可能该兔源沙门氏菌菌株已产生对阿米卡星的耐药性。氧氟沙星与恩诺沙星属于喹诺酮类抗生素，其是广谱、高效、杀菌力强的一类化学合成抗菌药物，抑制细菌DNA回旋酶，阻断DNA合成和复制致细菌死亡，在该试验中对沙门氏菌产生了一定的抑菌作用。磺胺嘧啶钠与磺胺间甲氧嘧啶属于磺胺类抗生素，是广谱、慢作用型抑菌药物，对大多数G+菌和部分G-菌有效，对沙门氏菌较为敏感，它们在该试验中抑菌效果较好，但抗菌活性较弱，与其他抗菌药物联合效果更好，其主要是干扰细菌叶酸代谢而抑制其生长繁殖。阿莫西林与青霉素属于β-内酰胺类抗生素，杀菌力强，对G+菌、部分G-球菌及G+球菌等高度敏感，毒性低，但细菌可产生相应的酶破坏β-内酰胺环，是产生耐药性的主要原因。但这2种抗生素在该试验中效果并不理想。
3.2 2种抗生素体外联合药敏试验
联合试验中，抗菌药物可表现为协同、相加、无关、拮抗4种作用，抗生素可根据其对细菌作用方式分为四大类：青霉素与阿莫西林属于 Ⅰ 类抗生素（繁殖期杀菌药），可阻断粘肽的合成，影響细胞壁结构，有较强的杀菌效果，庆大霉素、阿米卡星、恩诺沙星与氧氟沙星属于Ⅱ类抗生素（静止期杀菌药），对静止期细菌有较强杀灭作用，阻碍蛋白质合成，磺胺嘧啶钠与磺胺间甲氧嘧啶属于Ⅳ类抗生素（慢效抑菌药），作用于细菌叶酸转化，影响菌体合成蛋白质。
协同作用组：阿莫西林+氧氟沙星是Ⅰ 类+Ⅱ类联合可能呈现协同作用，该试验结果与理论相符，也与李荣誉等[11]研究结果一致，对庆大霉素与氧氟沙星来说，同类抗生素不宜联用，但作用点不同的抗生素可以联用，如庆大霉素与喹诺酮类、磺胺药与抗菌增效剂等可阻碍蛋白质合成的不同环节，可产生增强或相加作用[12]，在该试验中呈现协同作用，与肖华平等[13]试验结果相一致。无关作用组：阿米卡星+磺胺嘧啶钠、阿米卡星+磺胺间甲氧嘧啶属于Ⅱ类+Ⅳ类联用，可获协同或相加作用，恩诺沙星与阿米卡星同为Ⅱ类抗生素，影响菌体内蛋白质合成的不同环节，所以在联合用药可产生增强或相加作用，此外在刘玲红[14]的试验结果中也呈现出良好的抑菌效果，但该试验中呈现出无关作用，在单药抑菌效果中阿米卡星效果比庆大霉素效果差，可能是该兔源沙门氏菌菌株已产生对阿米卡星的耐药性，影响了这3组的联合药敏试验结果。拮抗作用组：庆大霉素+磺胺嘧啶钠、氧氟沙星+磺胺间甲氧嘧啶均属于Ⅱ类+Ⅳ类联用，可获协同或相加作用，但该试验结果与理论不符，可能是因磺胺类药物易碱化产生沉淀而导致结果产生误差，青霉素+阿米卡星属于Ⅰ类+Ⅱ类联合，可获协同作用[13]，而该试验联合用药产生拮抗作用，是否与此时氨基糖苷类产生抑菌作用有关则有待进一步研究。
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