宫颈癌组织及细胞株中长链非编码RNA CCAT1的表达水平及意义①

王圣坦 朱根海 纪 武 洪 澜 王 雁 陈春英 王 康

(海南省人民医院妇科，海口 570311)

宫颈癌在发展中国家发病率居高不下，是妇科生殖道常见恶性肿瘤之一，我国宫颈癌发病率已高达万分之一，且其发病年龄逐渐年轻化，严重威胁女性生命健康[1]。宫颈癌的发病机制复杂，涉及遗传、环境等多种因素的影响，现有的医疗手段治疗效果均不佳，近几年随着肿瘤分子学的发展，肿瘤分子靶点成为研究热点[2]。研究显示，长链非编码RNA在肿瘤的发生发展中有着重要的调控作用[3]；肠癌相关转录因子1(colorectal cancer associated transcription factor 1，CCAT1)是一种长链非编码RNA，据报道CCAT1参与多种肿瘤的发生发展[4,5]，但国内关于CCAT1与宫颈癌的报道较少，故本研究观察了CCAT1在宫颈癌组织中表达情况和CCAT1对宫颈癌细胞增殖的影响，并初步分析其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本和细胞株 宫颈癌组织及对应癌旁正常组织(距癌<3 cm)取自2015年1月至2017年6月接受宫颈癌根治术的48例宫颈癌患者，所有患者术前均未接受放化疗，且标本经病理学检查确诊为宫颈癌；人正常宫颈鳞状细胞系ECT1/E6E7，宫颈癌细胞株Hela、C33A长期冻存于实验室液氮罐中，本研究已通过医院伦理委员会批准，且患者均签署知情同意书。

1.1.2试剂与仪器 DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000试剂盒、PCR引物购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁公司；PimeScript RT Reagent Kit逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；Quanti-FastSYBR Green PCRKit荧光定量RCR试剂盒购自德国Qiagen公司；Tublin、RASSF1A、cyclin D1蛋白一抗购自美国Cell signaling technology公司；实时荧光定量PCR仪、酶标仪、全自动凝胶成像系统购自美国伯乐公司；流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR检测组织和细胞中CCAT1的表达 采用TRIzol法提取宫颈癌组织、癌旁正常组织及细胞样本中总RNA，并用紫外分光光度计进行RNA定量及纯度分析；参照PimeScript RT Reagent Kit说明书进行逆转录得到cDNA；参照QuantiFastSYBR Green PCRKit说明书进行qRT-PCR检测；通过熔解曲线观察PCR产物特异性，采用2-ΔΔCt法以GADPH mRNA的表达为内参，分析CCAT1的相对表达水平。基因序列[6]如下：CCAT1上游引物：5′-TTTATGCTTGAGCCTTGA-3′，下游引物：5′-CTTGCCTGAAATACTTGC-3′；GAPDH上游引物：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。反应条件为：92℃、3 min预变性，92℃、30 s变性，58℃、15 s退火，72℃、1 min延伸，共39个循环。

1.2.2细胞培养 宫颈癌细胞株Hela、C33A解冻后，应用 DMEM培养基+10%胎牛血清+1%青链霉素混匀，于37℃、5%CO2培养箱中恒温培养，取生长状态良好的细胞用于后续实验，并作保种冻存。

1.2.3细胞分组与转染 将细胞按适宜密度接种至6孔板，分组为正常对照组(Con)、siRNA-NC组和siRNA-CCAT1组，正常培养Hela、C33A细胞为Con组，Con组不作转染处理；siRNA-NC组和siRNA-CCAT1组细胞用无抗生素培养基培养，每6 h 换1次培养基，当细胞融合至40%～60%时，参照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行转染；转染24 h 后通过qRT-PCR检测CCAT1的表达，选择沉默效率较高的细胞用于后续实验。

1.2.4CCK-8检测细胞增殖 将转染后细胞按适宜密度接种至96孔板，参照CCK8试剂盒说明书检测细胞增殖率，将Con组、siRNA-NC组和siRNA-CCAT1组细胞分别培养24 h、48 h和72 h，每个时间点作5个复孔；每孔加入10 μl CCK-8试剂，37℃孵育1 h后终止培养，应用酶标仪测定每孔在450 nm波长处的吸光值，并绘制折线图。

1.2.5流式细胞仪检测细胞周期 待转染后细胞融合至80%时收集起来，用预冷PBS缓冲液清洗细胞后，固定于甲醇中，4℃下孵育30 min，加入碘化丙啶染液，染色30 min，流式细胞仪进行细胞周期检测。

1.2.6Western blot检测细胞中RASSF1A、cyclin D1的表达 收集转染后细胞，采用RIPA法提取样品总蛋白，BCA法进行蛋白定量；取70 μg蛋白点样至SDS-PAGE凝胶中电泳，当溴酚蓝电泳至电泳仪底部时终止，再将凝胶中蛋白电转至PVDF膜上，浸没于5%脱脂奶粉中，37℃下封闭1 h；适度清洗后浸没于相应蛋白一抗(Tublin稀释比为1∶1 500、RASSF1A稀释比为1∶1 000、cyclin D1稀释比为1∶1 000)中，4℃下孵育过夜；适度清洗后浸没于二抗(稀释比为1∶8 000)中，室温下孵育40 min；适度清洗后加入ECL发光液，于全自动凝胶成像系统中检测蛋白图像，并绘制柱状图。

2 结果

2.1CCAT1在宫颈组织和细胞中的表达情况 如图1，通过检测宫颈组织和细胞中CCAT1的表达，发现宫颈癌组织中CCAT1的表达显著高于癌旁正常组织(2.28±0.85比1.15±0.53，t/P=7.816/0.000)；宫颈癌细胞Hela、C33A中CCAT1的表达分别显著高于正常宫颈鳞状细胞ECT1/E6E7(1.83±0.15比1.00±0.09，t/P=3.452/0.009；1.72±0.17比1.00±0.09，t/P=8.370/0.000)。

图1 CCAT1在宫颈组织和细胞中的表达情况Fig.1 CCAT1 expression in cervical tissues and cellsNote: A.CCAT1 expression in cervical tissues;B.CCAT1 expression in cervical cells.Compared with normal cervical tissues or cells,*.P

表1 宫颈癌中CCAT1的表达与临床病理表征的关系

Tab.1 Relationship between expression of CCAT1 in cervical cancer and clinicopathological features

ClinicopathologicalfeaturesnCCAT1 highexpressionCCAT1 lowerexpressionχ2PAge(year)0.1390.709>6018108≤60301515The degree of differentiation0.1670.683High differentiation-medium differentiation321616Poorly differentiated1697Tumor size(cm)5.4080.020>423167≤425916TMN staging10.3260.001Ⅰ-Ⅱ26818Ⅲ-Ⅳ22175Lymphatic metastasis6.9360.008Yes25196No23617

2.2宫颈癌中CCAT1的表达与临床病理表征的关系 根据宫颈癌组织中CCAT1相对表达量的平均数为2.28，将48例宫颈癌患者分为CCAT1高表达组(CCAT1相对表达量>2.28)和CCAT1低表达组(CCAT1相对表达量≤2.28)，分别为25例和23例，分析CCAT1表达与宫颈癌临床病理特征的关系，结果表明TMN分期较晚、肿瘤大、有淋巴结转移的宫颈癌患者宫颈癌组织中CCAT1相对表达量更高(均P<0.05)；不同年龄、分化程度患者中CCAT1的表达无显著性差异(均P>0.05)，见表1。

2.3沉默CCAT1后对Hela、C33A细胞中CCAT1表达的影响 如图2，应用siRNA转染细胞Hela、C33A后，发现siRNA-CCAT1组细胞中CCAT1表达明显低于siRNA-NC组(Hela细胞：0.31±0.08比0.98±0.12，t/P=30.463/0.000；C33A细胞：0.36±0.07比1.05±0.11，t/P=33.266/0.000)；siRNA-NC组和Con组中CCAT1表达差异无显著统计学意义(均P>0.05)。

图2 沉默CCAT1后对Hela、C33A细胞中CCAT1表达的影响Fig.2 Effects of silencing CCAT1 on CCAT1 expression in Hela and C33A cellsNote: Compared with siRNA-NC group,*.P

图3 沉默CCAT1后对Hela、C33A细胞增殖的影响Fig.3 Effects of silencing CCAT1 on proliferation of Hela and C33A cellsNote: A.Hela cell；B.C33A cell.Compared with siRNA-NC group,*.P

2.4沉默CCAT1后对Hela、C33A细胞增殖的影响 如图3，通过CCK-8法检测转染后Hela、C33A细胞培养24 h、48 h及72 h的增殖活性，随着培养时间的延长，细胞增殖的越缓慢，siRNA-CCAT1组细胞增殖活性明显低于siRNA-NC组(均P<0.05)，siRNA-NC组和Con组中CCAT1表达差异无显著统计学意义(均P>0.05)，具体吸光度值见表2。

2.5沉默CCAT1后对Hela、C33A细胞周期的影响 如图4，通过流式细胞仪检测Hela、C33A细胞周期，siRNA-CCAT1组处于G0/G1期细胞百分比显著高于siRNA-NC组(均P<0.05)，而S期和G2/M期细胞百分比与siRNA-NC组差异无显著统计学意义(均P>0.05)，具体值见表3。

图4 沉默CCAT1后对Hela、C33A细胞周期的影响Fig.4 Effects on cell cycle of Hela and C33A after silenc-ing CCAT1Note: A.Hela cell；B.C33A cell.Compared with siRNA-NC group,*.P

GroupsHela24 h48 h72 hC33A24 h48 h72 hCon0.68±0.121.13±0.151.42±0.141.12±0.131.56±0.161.75±0.15siRNA-NC0.72±0.141.16±0.141.50±0.161.15±0.141.62±0.151.79±0.14siRNA-CCAT10.52±0.131)0.84±0.151)1.05±0.131)0.82±0.161)1.18±0.151)1.36±0.151)t2.3413.4874.8813.4714.6384.686P0.0470.0080.0010.0080.0020.002

Note：Compared with adjacent normal tissues,1)P<0.05.

GroupsHelaG0/G1SG2/MC33AG0/G1SG2/MCon42.58±5.2935.26±3.6223.42±3.2945.23±6.5438.55±5.9319.54±3.67siRNA-NC43.51±6.1734.53±4.1622.88±3.5744.56±5.8236.84±6.2720.13±4.08siRNA-CCAT152.37±5.471)29.27±3.8419.59±3.2261.27±6.941)28.73±6.7214.27±4.57t2.4032.0781.5304.1251.9732.139P0.0430.0710.1650.0030.0840.065

Note：Compared with adjacent normal tissues,1)P<0.05.

表4 沉默CCAT1后Hela、C33A细胞RASSF1A、cyclin D1表达情况

Tab.4 Expression of RASSF1A and cyclin D1 in Hela and C33A cells after silencing CCAT1

GroupsHelacyclin D1RASSF1AC33Acyclin D1RASSF1ACon0.97±0.091.06±0.061.07±0.100.98±0.08siRNA-NC1.00±0.081.00±0.101.00±0.091.00±0.06siRNA-CCAT10.59±0.151)1.83±0.161)0.43±0.131)2.06±0.141)t5.3939.8368.06115.561P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with adjacent normal tissues,1)P<0.05.

图5 沉默CCAT1后对Hela、C33A细胞中RASSF1A、cyclin D1表达的影响Fig.5 Effects of silencing CCAT1 on expression of RASSF1A and cyclin D1 in Hela and C33A cellsNote: Compared with siRNA-NC group,*.P

2.6沉默CCAT1后对Hela、C33A细胞中RASSF1A、cyclin D1表达的影响 如图5，与siRNA-NC组相比，siRNA-CCAT1组中cyclin D1表达显著下调，RASSF1A表达显著上调(均P<0.05)；siRNA-NC组和Con组中RASSF1A、cyclin D1的表达差异无显著统计学意义(均P>0.05)，见表4。

3 讨论

长链非编码RNA是一类高度保守、特异性强的长序列转录本，其生理活性丰富，涉及机体多种生理过程，甚至参与调控肿瘤的发生发展[7]。长链非编码RNA尿路上皮癌相关分子(UCA1)[8]、X染色体失活特异转录子(XIST)[9]均在宫颈癌组织中异常高表达，且其表达水平与宫颈癌患者临床病理特征存在一定的关系，提示长链非编码RNA可能参与宫颈癌的发生、发展。CCAT1 是一个长度为2 628 nt、位于癌基因cMyc附近的长链非编码RNA[10]；研究发现，CCAT1可通过促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭过程，而参与胃癌[11]、结直肠癌[12]及前列腺癌[13]的发生发展。因此，猜想CCAT1在宫颈癌中可能具有相似作用。本研究发现，CCAT1在宫颈癌组织和细胞中异常高表达，且不同TMN分期、肿瘤大小、淋巴结转移情况患者中CCAT1表达有显著差异，提示CCAT1可能与宫颈癌的发生发展有关，与Zhang等[14]研究报道相似。

人体正常细胞在癌变、增殖、转移、复发等过程中伴随着多种基因的变异，从而引起相关功能蛋白表达的紊乱，故RNA干扰技术常应用于肿瘤的基因治疗与研究。本研究通过构建CCAT1低表达细胞系，探究沉默CCAT1后对宫颈癌细胞Hela、C33A增殖的影响，结果显示沉默CCAT1会显著抑制宫颈癌细胞的增殖，并使细胞停滞于G0/G1期。RAS相关区域家族1A蛋白(RAS correlation region family 1A，RASSF1A)是一种抑癌基因，其表达缺失会促进肿瘤的发生发展，可能通过诱导细胞周期停滞或引起细胞恶性转换；张秀平等[15]研究显示RASSF1A在宫颈癌组织中异常低表达，并抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭。细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)可与多种蛋白相互作用，促使细胞周期由G1期进入S期，诱导细胞的分裂与增殖；研究发现，Cyclin D1异常过表达与恶性肿瘤的发生发展密切相关，且与肿瘤患者临床病历特征及预后相关。廖铭心等[16]研究显示沉默hnRNP A2/B1基因通过下调cyclin D1的表达，抑制宫颈癌细胞增殖及生长。据报道，CCAT1可通过与miR-181a-5p互补配对调控上调RASSF1A、下调cyclin D1的表达，从而发挥抑癌作用[17]，本研究发现沉默CCAT1表达后会上调Hela、C33A细胞中RASSF1A、下调cyclin D1的表达，可能因此影响宫颈癌细胞的增殖能力。

宫颈癌的发生发展机制错综复杂，CCAT1作为一个新型的肿瘤调控分子，其具体作用机制尚不清楚。本研究发现沉默CCAT1表达可抑制宫颈癌细胞的增殖，使细胞停滞于G0/G1期，可能与调控RASSF1A、cyclin D1的表达有关，为揭示宫颈癌发生发展机制打下基础，但本文仅初步分析其具体作用机制，后期随着CCAT1与宫颈癌的深入研究，CCAT1将有望成为治疗宫颈癌的重要靶点。