α-L-岩藻糖甘酶1基因在小鼠不同组织中的表达分析

王 道，陈 璇，施晓波，陈建林

(中南大学湘雅二医院妇产科，湖南 长沙 410011)

α-L-岩藻糖苷酶1(α-L-fucosidase1, FUCA1)，是细胞表面上多聚溶酶体酸性水解糖的重要组分，可去除糖蛋白末端L-岩藻糖残基，而且在酸性pH值下表现出最佳活性。岩藻糖苷酶的缺陷会引起岩藻糖病，岩藻糖病是一种溶酶体贮积症，症状表现为精神运动性异常、血管角化瘤和生长迟缓[1]。到目前为止，学者们已经鉴定出Fuca1基因中29个不同的突变体存在于染色体1p34上，同时在机体内免疫、信号传导、细胞凋亡、精子成熟、配子间相互作用等方面发挥重要作用[2-4]。近年，研究人员发现结直肠癌[5]和乳腺癌[6]中的α-L-岩藻糖苷酶活性降低，而子宫内膜癌、卵巢癌以及甲状腺癌[7]和胃癌[8]中活性增加。多项研究[9，10]表明岩藻糖基化与肿瘤发生之间存在密切联系，但对Fuca1在肿瘤发生中的功能了解还不够。王道等[11]研究发现Fuca1和Fuca2基因在斑马鱼中的各组织广泛地表达，而且精巢和卵巢中存在高表达，提示Fuca1和Fuca2在鱼类胚胎发育和成体的精巢、卵巢与肝脏发育中可能具有重要的作用。本研究选用小鼠(C57BL/6)，探讨Fuca1基因在不同组织器官中的分化表达情况，为进一步了解Fuca1在高等动物中性腺发育的分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

成熟雌雄小鼠(C57BL/6)被人工饲养在湘雅二医院实验动物房，经麻醉后迅速分离本研究所需的组织器官(脾脏、心脏、大脑、肌肉、肾脏、睾丸、肝脏和卵巢)，然后用液氮速冻，置于-80 ℃冰箱贮存。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol Reagent购自美国英伟创津公司；FUCA1特异引物合成购自深圳华大基因公司； PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex TaqTM Mix购自日本Takara公司；鼠抗FUCA1(Ab181357)购自Abcam公司；ABI REAL 96荧光定量PCR仪器购自美国Applied Biosystems公司。

1.3 RNA的提取

镊子夹取小鼠8个组织样品置于研钵中，在液氮中充分快速研磨。然后按照Trizol法提取总RNA，并且使用琼脂糖凝胶(1.3%)电泳跑胶验证RNA完整性。同时，Beckman分光光度计验证RNA 浓度和纯度：RNA浓度(μg·L-1)=OD260×稀释倍数×40，浓度为100～500 μg·L-1；RNA纯度=OD260/OD280，比值在1.8～2.0均可。

1.4 实时荧光定量PCR

采用qPCR 检测Fuca1在小鼠8个组织(脾脏、心脏、大脑、肌肉、肾脏、睾丸、肝脏和卵巢)中的mRNA表达水平。qPCR 10 μL反应总体系包含：5 μL SYBR Mix，0.3 μL +/-Fuca1特异引物和GAPDH内参引物(见表1)，1 μL first cDNA，3.4 μL 无菌H2O，反应条件：50 ℃2 min；95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃45 s，45 个循环；每个组织样本都进行3次以上有效重复。按照8个组织的样本扩增曲线，确定扩增循环数(Ct值)，并且按照标准曲线分析计算mRNA相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物名称和序列信息

1.5 蛋白质免疫印迹杂交

采用Western Blot检测小鼠8个组织(脾脏、心脏、大脑、肌肉、肾脏、睾丸、肝脏和卵巢)中的FUCA1蛋白表达水平。研钵中研磨剪碎组织至粉末状并加入液氮，同时按比例加入蛋白抽提液(含蛋白酶抑制剂)，12 000 r·min-1离心20 min，取上清, 取5 μL 用于测浓度，其余分装保存于EP管中。利用Bradford 法测定总蛋白浓度。10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(上样量100 μg)后，蛋白被转移至硝酸纤维素膜，封闭液室温封闭1 h。鼠抗FUCA1单克隆抗体(200 g·L-1, 1∶1 000)，鼠抗β-Actin 单克隆抗体(200 g·L-1, 1∶2 000)，在4 ℃冰箱过夜。TBST 洗膜3 次，每次15 min 后，抗鼠IgG-HRP 抗体(1∶2 000)室温孵育1 h。用TBST 和 TBS分别洗膜2～3次，在暗室进行压片显影曝光。

1.6 核酸和蛋白质序列比对分析

从美国国立信息库NCBI获取10种不同物种的氨基酸序列，用Clustal Omega进行多序列比对分析。

2 结果

2.1 Real-time PCR结果

运用qPCR 检测Fuca1基因在小鼠8种组织的表达，ABI系统平台说明引物(FUCA1和GAPDH)溶解曲线呈现特异性单峰，最终数据表明，Fuca1基因在睾丸表达量最高，其次是卵巢和肾脏；较低表达依次出现在大脑、心脏和脾脏，但在肌肉和肝脏表达量最低(图1)。

2.2 Western Blot结果

在小鼠的8种主要组织中， FUCA1蛋白都存在表达且具有显著的表达水平差异性。肾脏中FUCA1蛋白的表达最高，表达居中的是卵巢、大脑、心脏、肝脏，肌肉、脾脏和睾丸表达最低(图2)。

1. Spleen; 2. Heart; 3. Brain; 4. Muscle; 5. Kidney; 6. Testis; 7. Liver; 8. Ovary图2 FUCA1在小鼠各组织的蛋白表达分析Fig. 2 Relative level of FUCA1 protein expression

2.3 氨基酸序列比对和系统进化树结果

使用Clustal Omega分析软件对GenBank中已发表的10种脊椎动物(斑马鱼、鸡 、非洲爪蟾、大鼠、小鼠、犬、牛、猪、人、猕猴)的FUCA1氨基酸序列进行同源性比对分析(图3)。结果显示，以上物种FUCA1相同的氨基酸有207个，相似的氨基酸有104个，同源性仅为43.035%，说明该氨基酸序列保守性不高。

同时利用Clustal Omega软件(HH法)对上述多重比较氨基酸序列进行聚类分析，结果显示(图4)，小鼠和大鼠聚为一支，斑马鱼、鸡、非洲爪蟾则聚为另外一支。而且，牛和猪单独形成一支，人和猕猴又形成另外一支。与小鼠亲缘关系最近的是大鼠，其次是犬，其它的脊椎动物亲缘较远。

3 讨论

FUCA1是一种溶酶体蛋白，在哺乳动物中起着重要生理作用[12]，参与了由Fuca1基因突变引起的恶性遗传疾病。Kielian[13]的研究证实在大多数缺陷型小鼠的组织中，很容易检测到大量空泡，甚至在肾小球足细胞、肾小球系膜细胞和近端小管观测出溶酶体贮藏病理变化。此外，FUCA1还能够糖基化许多信号蛋白[14-16]。

本研究发现，在mRNA水平上，FUCA1在睾丸中表达最高，在肌肉和肝脏最低；免疫印迹技术则证实了FUCA1在小鼠8个组织都有广泛的表达，而且最高表达出现在肾脏而不是睾丸，脾脏和肌肉中出现最低表达，有趣的是，与其相应的mRNA上表达比较，可以发现并非呈线性关系。根据以前中心法则，DNA编码序列被转录为mRNA，然后被翻译为蛋白质。尽管蛋白质的合成及降解的速率均发生变化，但蛋白质的丰度取决于其mRNA的丰度。此过程涉及许多调控，大量研究报告认为，两者之间的相关性通常较低[17-19]。JAX实验室研究人员测量来自192个多样性近交系小鼠的肝脏中的全基因组转录本和蛋白质表达，推测定量性状位点(quantitative trait locus, QTL)是靶基因附近的遗传变异，会影响其表达，可能QTL会顺式作用并影响转录本和蛋白质水平，远端的QTL对靶基因在反式中的表达发挥作用[20]。人们已经在酵母和植物中研究了蛋白质和转录水平的一致性，但Anatole等[21]进行小鼠比较研究表明，转录物和蛋白质的水平仅与约一半的测试基因显著相关，平均相关系数为0.27。蛋白质和转录本之间的关系可能部分能用分子事件来解释，如翻译效率、选择性剪接、折叠、组装成复合物；转运和定位、共价修饰、分泌和降解等都会影响蛋白质水平，而且与转录本无关。本文结果中睾丸组织的转录本和蛋白水平表达不一致，笔者推测是该基因翻译过程中可能接受一系列的化学修饰信号，如miRNA，使其蛋白水平下调，翻译表达后被部分降解[22,23]，还可能是在翻译后受到磷酸化、硫酸化、泛素化等。

“*”代表保守的氨基酸残基;“:”代表保守替换的氨基酸残基;“.”代表相似性氨基酸。图3 不同脊椎动物FUCA1氨基酸序列比对分析Fig. 3 Amino acid sequence analysis of FUCA1 from different species

图4 不同物种FUCA1系统进化树Fig. 4 Phylogenetic tree of FUCA1 in different species

关于Fuca1在生殖领域的作用研究越来越多，特别是在大鼠、果蝇及海鞘等动物中，Fuca1与性腺发育及精卵识别融合有关[24,25]。Maria等[26]发现果蝇不同组织Fuca1mRNA表达存在差异性，且精巢中表达最高，王道等[11]也发现在斑马鱼精巢和卵巢中FUCA1的表达量较高，黄鳝中的FUCA1在雌性性腺中的表达量明显高于雄性性腺[27]。以往文献[28，29]报道加入FUCA1抗体能使小鼠受精率下降,添加外源性FUCA1能促进精子获能，因此笔者推测Fuca1可能在小鼠性腺发育及精子成熟过程中起重要作用，这有待我们深入研究来提供更多证据。