刚地弓形虫VEG株速殖子感染宿主细胞最优接种比的曲线拟合分析

郭海婷，谭 洁，夏春波，荣翠平，邹珍友，李中原,2

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种重要的机会致病性原虫，专性有核细胞内寄生，能够感染包括人类在内的所有恒温动物，对人体健康、公共卫生安全和畜牧业生产均危害严重[1-2]。值得注意的是，弓形虫分布极其广泛，拥有速殖子、缓殖子和卵囊等多种感染形态，能够突破血-脑和血-胎屏障造成人和动物感染，但作用机制至今尚不清楚，是深入研究病原微生物触发生命体行为异常和解析先天性感染幸存胎儿智力发育不全作用机理的重要模式生物[3-5]。作为毒株传代、制备突变株、开展预实验和验证实验结果的中心环节，体外培养对探明弓形虫速殖子毒力基因功能及其致病机制都至关重要[6]。据报道，以24孔细胞板对弓形虫RH株速殖子进行体外培养时，虫体感染量与宿主细胞起初铺入数间紧密相关[7]，至于弓形虫其他毒株或培养类型，目前尚无报道。因此，本文以非洲绿猴肾细胞(即Vero细胞)为研究对象，运用96孔、24孔、12孔、6孔细胞板和25T培养瓶对弓形虫VEG株速殖子进行体外培养，经Real-time PCR定量和曲线拟合分析，旨在探讨不同感染梯度的弓形虫速殖子对宿主细胞侵蚀能力强弱的影响及二者间存在的接种比例关系。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1弓形虫毒株与细胞系 弓形虫VEG虫株(Genotype III)受中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室朱兴全研究员惠赠，宿主Vero细胞系由广西脑与认知神经科学重点实验室传代保存。

1.1.2主要仪器、耗材和试剂 MX3005P型Real-time PCR荧光定量基因扩增仪购自德国Agilent公司；96孔、24孔、12孔、6孔细胞培养板(平底)和25T细胞培养瓶(斜颈，矩形)为Thermo Fisher Scientific公司产品；TIANamp Genomic DNA Kit购自天根生化科技(北京)有限公司；Real-time PCR EasyTM SYBR Green I为福际生物技术(成都)有限公司产品。

1.2 方 法

1.2.1细胞培养 待传代的宿主Vero细胞系经0.25%胰酶消化和血细胞计数板精确计数后，用10% FBS/DMEM培养液稀释至1.0×105个/mL，按照每孔0.1 mL、0.5 mL、1.2 mL和2.5 mL的上液量分别铺入96孔、24孔、12孔和6孔细胞培养板；将所得细胞稀释至1.74×105个/mL，移取4.5 mL铺入25T培养瓶内，37 ℃ 5% CO2培养箱孵育12 h，备用。

常规培养并收集弓形虫VEG株速殖子，经破碎、纯化和计数后用10% FBS/DMEM培养基稀释至1.0×105个/mL并倍比稀释出7个浓度梯度，依次加入上述96孔(0.1 mL/孔)和24孔(0.5 mL/孔)细胞培养板中；将所得速殖子分别稀释至1.5×105个/mL、5.0×105个/mL和1.56×106个/mL，并作同上倍比稀释，按0.8 mL/孔、0.5 mL/孔或0.5 mL/瓶的感染剂量依次加入上述12孔、6孔细胞板或25T培养瓶中，以使首孔/首瓶内宿主细胞铺入数与弓形虫感染数相同；于37 ℃ 5% CO2培养箱内连续培养4 d，实验重复3次。

1.2.2样品收集与DNA提取 待培养结束，运用移液器枪头或细胞刮刮净并全量收集96孔、24孔细胞板内培养物，其他细胞板和培养瓶内所得物经充分吹打混匀和测定总体积后各取0.5 mL，分别用于基因组提取，具体操作方法依照天根生化科技(北京)有限公司TIANamp Genomic DNA Kit使用说明进行(洗脱体积均为50 μL)。

1.2.3Real-time PCR定量检测 精确计数弓形虫VEG株速殖子8.3×106个，同上提取基因组并10倍稀释出6个浓度梯度，用来绘制所需的标准曲线。依据文献[8]，合成一对用来定量分析待检样品中弓形虫VEG株速殖子数目的特异性引物(即上游：5′-TCGGTGACGAAGCCCAAA-3′；下游：5′-AGTTCGTTGTAGAAGGTGTGA-3′)，经Real-time PCR定量扩增，分别计算出感染4 d时各细胞板和培养瓶内的虫体数。

2 结 果

2.1弓形虫VEG株速殖子数 参照文献[8]，合成一对特异性引物(预期扩增片段大小为121 bp)，经Real-time PCR定量检测来系统评价不同感染梯度的弓形虫VEG株速殖子作用4 d时对侵蚀宿主Vero细胞能力的影响，所得结果如表1所示。不难发现，弓形虫速殖子对宿主细胞侵蚀能力的强弱程度与其感染量和所用耗材规格间关系密切，即速殖子感染量及所用耗材对弓形虫侵蚀宿主细胞的能力均影响明显。

表1 弓形虫VEG株接入宿主细胞4 d时各培养孔/瓶内的速殖子数目Tab.1 Number of parasites in the well or bottle at 4 d post-infection with T. gondii VEG strain

2.2曲线拟合与回归趋势分析 假设自变量x[即LOG(VEG速殖子感染数/宿主细胞数，2)]与因变量y[即培养4 d时各细胞板和培养瓶内VEG速殖子数]之间有回归关系，本文依照最小二乘法基本原理[9-10]，运用多项式函数(二次、三次和四次)、线性函数、指数函数以及生长曲线(Pearl model和Gompertz model)等7种常见曲线回归模型对弓形虫VEG株速殖子感染宿主Vero细胞4 d时的虫体平均数进行拟合分析，并分别求解残差平方和Q值、决定系数R2和F值。结果显示，拟合四次多项式时所得Q值最小，且决定系数R2、F值最大(图1)，表明四次多项式为弓形虫速殖子感染宿主细胞4 d时的最佳拟合曲线方程，其回归趋势如图2所示。

Note: * indicates that the regression trend for the fitting curve is inconsistent with the expected results.图1 7种常见回归曲线的拟合度分析Fig.1 Fitting degree analyses for the seven common models of regression curves

A: Quantitative analysis curve for the Real-time PCR; B-F: The numbers of VEG parasites at 4 d post-infection and their regression curves for 96-, 24-, 12-, 6-well plates and 25 T bottles, respectively (n=3).图2 Real-time PCR标准曲线与最佳拟合函数方程的回归趋势分析Fig.2 Standard curves for Real-time PCR and the regression trend analyses for the best model

2.3参数统计与建议接种比 运用Excel工具和SPSS 22.0统计学软件，分别对感染4 d时96孔、24孔、12孔、6孔细胞板和25T培养瓶中VEG速殖子所得最佳回归函数方程的拟合系数进行求解，结果如表2所示。

通过对所有四次多项式函数求二阶导数和令其为0，分别解得：96孔板，x1=-7.90，x2=-2.85；24孔板，x1=-6.34，x2=-2.41；12孔板，x1=-5.99，x2=-2.18；6孔板，x1=-5.93，x2=-2.01；25T培养瓶，x1=-5.43，x2=11.48，故96孔、24孔、12孔、6孔细胞板和25T培养瓶作用4 d时VEG速殖子感染数与宿主细胞数间建议接种比依次为2-7.90(舍弃)或2-2.85，2-6.34(舍弃)或2-2.41，2-5.99(舍弃)或2-2.18，2-5.93(舍弃)或2-2.01，2-5.43或211.48(舍弃)，即1/7.20，1/5.32，1/4.53，1/4.03和1/43.02(表2)。

3 讨 论

作为一种重要的人兽共患性原虫，刚地弓形虫已经成为探讨病原微生物导致机体发病如人和动物行为异常、幸存胎儿智力发育不全及其作用机制的主要模式生物[5,11]。加之，体外培养弓形虫是获取速殖子、产生目的基因缺失株及其补充株、进行预实验和所得结论验证的重要途径，对阐明弓形虫引起机体发病及其分子机制的作用不容忽视[12-13]。因此，研究弓形虫速殖子感染量与宿主细胞起初铺入数间的接种比例具有实用价值。前期研究结果显示，采用24孔细胞板对弓形虫RH株速殖子进行体外培养时，后者感染量与宿主Vero细胞铺入数之间存在接种比例关系[7]，对于其他虫株或培养类型，至今没有报道。因此，本研究继续以Vero细胞为实验对象，分别用96孔、24孔、12孔、6孔细胞板和25T培养瓶对VEG株速殖子进行体外培养，保证宿主细胞铺入密度及首个速殖子感染浓度与细胞起初铺入数相同的情况下作用4 d，经Real-time PCR定量，以7种常见曲线回归模型对所得速殖子数目的平均值进行拟合分析，明确所用耗材规格与弓形虫速殖子起初感染量对侵蚀宿主细胞能力影响的同时，探讨存在二者之间的接种比例关系。

表2 细胞培养板/瓶内速殖子最佳回归曲线的参数统计与建议接种比Tab.2 Parameters of the best regression curves and the inoculation ratios for T. gondii in plate or bottle

Real-time PCR定量检测结果显示，弓形虫VEG株速殖子起初感染量与所用耗材规格均对弓形虫入侵宿主细胞的能力影响明显，提示同种耗材培养条件下，虫体感染量与宿主细胞铺入数间关系紧密。经曲线拟合进一步分析发现，四次多项式是弓形虫感染宿主细胞4 d时的最适回归曲线方程，且所得速殖子无法拟合幂和对数两种函数类型，与我们前期研究结果相一致[7]。通过对所得四次多项式求导和求极值认为，运用同种耗材对弓形虫速殖子及其宿主细胞进行体外共培养时，二者之间存在最优接种比例关系，即96孔、24孔、12孔、6孔细胞板和25T培养瓶依次为1/7.20、1/5.32、1/4.53、1/4.03和1/43.02。综上所述，所用耗材的培养规格是造成各组间最优接种比差异明显的关键因素，所得结果可为日后深入研究弓形虫速殖子与宿主细胞间及二者与所用耗材规格间互相作用关系提供重要实验室参考依据。

利益冲突：无

引用本文格式：郭海婷，谭洁，夏春波，等.刚地弓形虫VEG株速殖子感染宿主细胞最优接种比的曲线拟合分析[J].中国人兽共患病学报，2020，36(2)：105-109. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.020