肺移植后闭塞性细支气管炎中运用微小RNA的价值

吴维栋 黄 麟 吴炜焊 朱 勇

福建医科大学附属协和医院胸外科，福建福州 350001

真核生物的细胞浆粗面内质网周围存在的长约20～25kb的一类内源性的非编码RNA，我们称之为微RNA（microRNA，miRNA），并且微RNA对其生物具有一定的调节控制作用，基本上有较多的miRNA基因都存在于基因组的基因间隔区、外显子区或者基因的内含子之间。经过成熟的单链miRNA分子和靶mRNA序列相互组合，对mRNA进行调节。并且以后发展过程中针对OB得的研究方法，主要是从基因组学入手，下面我们将会起到更多作用的TRPC1蛋白和指定的miRNA相互结合，进行分析研究，得出一定结论。

1 资料与方法

1.1 实验材料

购买华中科技大学动物中心的清洁级SD大鼠24只，圴为雄性，重量250～350g，随机分为模型组、对照组。SPF级近交系Brown Norway（BN）大鼠6只和Lewis大鼠18只，供体为BN大鼠，受体为Lewis大鼠；对照组中的供体和受体都采用的是Lewis大鼠。

1.2 方法

分别选用SPF级近交系Brown Norway（BN）大鼠6只和Lewis大鼠18只建立肺移植动物模型。模型建立分为两组，模型组的供体为BN大鼠，受体为Lewis大鼠，而对照组中供体和受体都使用的是Lewis大鼠，首先将作为供体的BN大鼠腹腔部位用10%水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司，H37022673）4mL/kg进行麻醉，颈胸部位经过消毒后，中间部位划出小口看到气管，再将整段气管取出来，并去掉气管外的隔膜组织，修整好气管两段，供体则使用5环1段，用4℃生理盐水冲洗干净之后浸泡留用[2]。然后对作为受体的Lewis大鼠使用同样方法让气管暴露在外，在不伤害喉部神经的情况下，以环状软骨下第4、5环间为中心上下对两环气管分开，完全分离后对气管取出，在第4、5环之间划开气管，膜部保留1/5的完整。对气管内存在的分泌物经过清理后植入供体气管。植入过程中注意尾侧重合，膜部对膜部，软骨部对软骨部，用7-0尼龙线在正上方先缝合一针固定，之后在左右两侧中间再进行一针缝合，最后一针则对正下方位置进行缝合，要先将膜部缝合好之后才能对头侧进行合成，最后一针在中间上方进行缝合从而完成气管移植。手术2个月后OB模型建组建成功[3]。

通过在模型组和对照组各取6例大鼠，筛选出大鼠移植气管组织在miRNA方面的的差异，具体方法为：对手术将个月后组建模型成功的大鼠进行研究，将移植的气管完整取出，并分为相同的三段，一段用于进行病理学试验，提取另一段提取完整RNA，最后放置一段用于之后的研究讨论，最后通过送往上海具有先进技术的基因化学技术单位对miRNA基因芯片进行检测，对两组大鼠miRNA表达差异进行对比。通过RT-qPCR方法对miRNA进行验证。

1.3 观察指标

（1）检测移植气管组织病理反应。（2）讨论miRNA芯片的治疗成效。（3）使用RT-qPCR验证芯片得到结果。

1.4 统计学方法

应用SPSS22.0统计学软件对数据进行处理和分析，计量资料以（±s）表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 移植气管组织病理学检测成果

对1个月后因闭塞性细支气管炎组建成功的移植气管，和同时间内对照组移植的大鼠气管进行实验对比，发现两组大鼠气管伤口均恢复较好，气管周围颈部肌肉也逐渐长出，软骨特征明显，未出现其他问题，另外移植的气管病理状况经过苏木精-伊红染色检查，模型组的移植气管恢复情况较好，未出现明显的病变反应，或仅仅是出现轻微的炎症；而因模型组闭塞性细支气管炎的移植气管，其气管壁出现不同程度病理反应，主要是内部上皮发生异常或者出现黏膜腺体消失的状况。见图1。

图1 大鼠移植气管的病理变化图

2.2 miRNA芯片研究检测结论

通过使用600个miRNA芯片对模型组的移植气管和对照组miRNA表达差异进行分析研究，经过对比分析检测结果发现差异表达miRNA较为显著的有70个，模型组的移植气管和对照组差异表达值控制在0.6～2.1的有40个，总差异表达miRNA的占比为57.15%，其检测结果无明显差异。差异表达miRNA明显的有30个，总差异表达miRNA的占比为42.85%，中间有16个差异表达明显下调，差异表达明显miRNA的占比为53.33%；表达明显上调的有14个，差异表达明显miRNA的占比为46.67%。

2.3 芯片采用RT-qPCR验证得出结论

对同等数量的表达明显上升的miR-146a、miR-155和表达明显降低的miR-451，以miRNA微阵列芯片检验的最终结论为基础进行检测，从而使得RT-qPCR验证得出的结果更为精确，经过分析研究发现模型组miR-146a和miR-155基因与对照组的表达量结果无明显区别；模型组miR-451基因表达量明显高于对照组，其对比结果有明显差异，对之后研究的准确性提供了理论依据。

利用预测miRNA靶基因常用的TargetScan数据库预测两组差异表达显著的miRNA靶基因。作为本研究模型组miRNA靶基因的代表，其中miR-146a靶基因是IRAK1和TRAF6，前者与白细胞介素1引起的核因子KB上调有关，后者参与炎症细胞反应；miR-155靶基因为TSHZ3，其参与转录调控；而miR-451的靶基因则是Tollip，与炎症调节有关。

3 讨论

经研究发现，经过肺移植后出现死亡主要是因为出现闭塞性细支气管炎（obliterative bronchiolitis，OB），发生的原因是因为小气道周围炎性淋巴细胞浸润，造成出现的纤维增生和瘢痕阻塞细支气管，导致肺功能出现病变。大约有一半的OB都是出现在肺移植五年后，10年出现OB的概率高达80%。严重的发生OB五年后死亡率高达60%。所以要保证肺移植远期的治疗效果更稳定，需要有效的控制患者出现OB。目前研究表明OB主要通过纤维化、淋巴细胞及抗体介导途径等机制致病，至OB的终末阶段，呼吸道上皮的损伤使炎症细胞浸润、上皮细胞脱落、基底祖细胞锐减，其中可能发生小气道上皮-间质转化（epithelial tomesenchymal transition，EMT），使纤维母细胞过度累积和纤维增生[6]。以单一的全方位存在细胞膜上的阳离子通道作为经典瞬时受体电位通道（transient receptor potential channel，TRPC），哺乳动物TRPC又被分为TRPC1～7七个亚型参与各种细胞的钙离子内流，调节Ca2+浓度从而影响细胞的功能[7]。哺乳动物TRP通道一开始指的就是TRPC1，我们认为其作用主要是将细胞膜受体激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC）中的钙离子进入，参与钙依赖的平滑肌及腺体的分泌和收缩功能[8]。微RNA（microRNA，miRNA）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其长约20～25kb，主要存在于细胞浆粗面内质网附近[9]。基因组的基因间隔区或者基因的内含子中含有大量的miRNA基因。通过将完整的的单链miRNA分子与靶mRNA序列互补配对，调节mRNA的翻译。

有部分学者认为主要是因为免疫系统出现排斥反应，才造成出现肺移植闭塞性细支气管炎[10]，还有就是其他非免疫因素也会出现这种情况，为降低肺移植排斥问题一直着重于分析研究怎样做好适应性免疫，根据众多的实验检测证明，出现闭塞性细支气管炎的主要原因是体液免疫、自体免疫、固有免疫等这些方面出现问题，并且出现免疫排斥反应的主要位置是气道上皮（airwaye Pithehalcen，AEC），miRNA对众多的重要生命过程都有着很大影响[11]。经过检测证明，miRN作为免疫调控因子，包括了对固有性免疫应答与炎性反应进行调节控制，较为明显的是，要想做好免疫细胞信号转导的调节，离不开miRNA的重要调节控制[12]。要进一步认识了解移植后闭塞性细支气管炎发病原因，需要通过分析检查出miRNA的差异性表达和功能机制。当下我们使用最频繁的筛查miRNA差异表达的方法是miRNA全基因谱芯片法，这种方法在使用过程中存在一定的局限性，因此需要进一步利用RT-qPCR等方法进行检测，进而保证结果的准确性[13]。

现在在关于miRNA的作用和质量方面仅仅是发现了一小部分，还有更大的空间供我们去研究探索，不断的发现miRNA可以让我们更好对不同的生理病理机制进行分析，同时可以采用新的治疗方法和理论依据对疾病进行诊治。经过研究证明，miRNA表达经过精准控制可以调节出一种节能而又有效的调节通路。在不断的发现miRNA作用的过程中，分析出转录因子和剪接因子这两种基因表达的重要调节因子与miRNA之间可以进行直接或间接的相互调节控制。现在是主要在miRNA功能中发现探索并分析确定miRNA直接作用的靶基因同时了解其调控机制。miRNA在转录后是以水平调节基因的小分子RNA形式表达出来的，通过转录因子相结合，将共同作用的靶基因在出现免疫和炎症反应下进行调节，在免疫系统中有着重要的作用。经研究证实，通过使用miR-451对癌基因C-myc及细胞周期正向调节因子的表达水平，可以阻止细胞周期的发展，也避免细胞过快的增加繁殖。

经过全面分析讨论，微小RNA可以更好的调节控制在肺移植后出现闭塞性细支气管炎的病情发展状况。