知黄溃疡合剂质量标准研究*

郭廷东，王娅俐，彭贤东，张仕瑾，吴 亮，唐志立

（四川省南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院药学部·个性化药物治疗南充市重点实验室，四川 南充637000）

知黄溃疡合剂是由熟地黄、知母、黄柏、玄参、茯苓、五味子、盐巴戟天、白及、川牛膝9味中药组方，是我院医师为解决传统汤剂携带不便的问题，根据临床经验对经典古方“引火汤”[1-2]改进所制的合剂，用于治疗复发性口腔溃疡[3]。课题组优选了提取工艺，并对其进行了口腔溃疡模型大鼠的药效学和急性毒性试验研究，结果显示，合剂能显著改善大鼠口腔溃疡组织的损伤，且无明显的急性毒性[4-6]。本研究中采用薄层色谱（TLC）法对制剂中熟地黄、黄柏、玄参进行了定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法对臣药黄柏中有效成分盐酸小檗碱进行了含量测定，为知黄溃疡合剂的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-16型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；BP211D型天平（北京赛多利斯仪器系统公司，精度为十万分之一）；1730QT型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

知黄溃疡合剂（四川省南充市中心医院制剂室提供，批号分别为180806，180808，180810）；盐酸小檗碱对照品（批号为110713-201212），熟地黄对照药材（批号为121196-201406），黄柏对照药材（批号为121510-201606），玄参对照药材（批号为121008-201609），均购于中国食品药品检定研究院；水为超纯水，甲醇和乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1TLC鉴别

熟地黄：取样品10 mL，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加甲醇1 mL溶解残渣，即得供试品溶液。另取熟地黄对照药材3 g，加水50mL，提取30 min，放冷，滤过，同供试品溶液制备方法制得熟地黄对照药材溶液。取缺熟地黄的阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。照2015年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC法试验，吸取上述3种溶液各5 μL，点于同一硅胶G板上，以甲苯-乙酸乙酯（1∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，均匀喷洒2，4-二硝基苯肼乙醇试液，在日光下观察。供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 A。

黄柏：取样品10 mL，蒸干，残渣加甲醇1 mL使其溶解，即得供试品溶液。取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液。另取黄柏对照药材0.1 g，加甲醇15 mL，超声处理30 min，过滤，同供试品溶液制备方法制得黄柏对照药材溶液。取缺黄柏的阴性样品，按供试品溶液制备方法制得黄柏阴性对照品溶液。照2015年版《中国药典（四部）通则0502 TLC法试验，吸取上述3种溶液各5 μL，点于同一硅胶G板上，以甲苯-异丙醇-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶2∶3∶2∶0.3，V/V/V/V/V）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，在紫外灯（365 nm）下观察。供试品溶液色谱图中，在与对照品及对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 B。

图1 薄层色谱图

玄参：取样品20 mL，加乙醚振摇提取2次，每次20 mL，去掉乙醚层溶液，再用水饱和的正丁醇溶液振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇层溶液，蒸干，残渣加甲醇1mL使其溶解，即得供试品溶液。另取玄参对照药材1 g，加乙醇20 mL，回流提取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 mL溶解，同供试品溶液制备方法制得对照药材溶液。取缺玄参的阴性样品，按供试品溶液制备方法制得玄参阴性对照品溶液。照2015年版《中国药典（四部）》通则0502中TLC法，吸取上述3种溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（5∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，均匀喷洒5%香草醛硫酸溶液，加热到斑点显色清晰，置日光下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 C。

2.2 盐酸小檗碱含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：GL Sciences Inc.Intertsil®ODS-3 RP C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（30∶70，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：265 nm；柱温：40℃；进样量：10 μL。在此色谱条件下，盐酸小檗碱与杂质分离度均大于1.5，理论板数不低于4 000。

2.2.2 溶液制备

取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含540 μg的溶液，即得对照品溶液。精密吸取样品10 mL置25 mL容量瓶中，用盐酸-甲醇（1∶100，V/V）定容至刻度，振摇过滤，取续滤液，即得供试品溶液。取缺黄柏药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

图2 高效液相色谱图

2.2.3 方法学考察

专属性试验：按拟订色谱条件对2.2.2项下3种溶液进样分析，记录色谱图（见图2）。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液相同保留时间处有相应色谱峰，阴性对照无干扰。

线性关系考察：精密吸取2.2.2项下对照品溶液2，4，6，8，10，12，18，20μL，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图。以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得盐酸小檗碱回归方程Y=478 454X+12 419，r2=0.999 9（n=8）。结果表明，盐酸小檗碱进样量在1.08～10.8 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2.2项下对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样测定6次。结果的RSD为0.38%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为180806）样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别于0，6，12，18，24 h时进样测定。结果的RSD为0.38%（n=5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好好。

重复性试验：取同一批（批号为180806）样品，依法平行制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果盐酸小檗碱的平均含量为1.646 mg/mL，RSD为0.72%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密吸取已知盐酸小檗碱浓度的样品6份，每份1 mL，分别精密加入盐酸小檗碱对照品溶液3 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）

2.2.4 样品含量测定

取3批（批号分别为180806，180808，180810）样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，计算盐酸小檗碱的含量。结果3批样品中盐酸小檗碱的含量分别为1.764，1.807，1.632 mg/mL。

3 讨论

3.1 指标成分选择

知黄溃疡合剂具有补肾水、泻火解毒、滋阴降火等功效，对复发性口腔溃疡有良好的疗效[6]。方中君药熟地黄的有效成分为毛蕊花糖苷，但其为糖苷，受pH及温度影响较大，且其含量检测方法的专属性不好，故不作为控制本品质量的指标成分[4]。黄柏可降低血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量，减轻炎性损伤，可治疗口腔溃疡[7]。成洪达等[8]将黄柏提取物制成双层口腔溃疡膜，用于治疗口腔溃疡。且黄柏中有效成分盐酸小檗碱是季铵碱，在酸性和高温条件下稳定，故本试验中选择盐酸小檗碱作为指标成分。

3.2 供试品溶液制备方法选择

供试品处理过程中，考察了不同提取溶剂对提取效率的影响。结果水＜50%甲醇＜流动相＜盐酸-甲醇＜甲醇，但用盐酸-甲醇（1∶100，V/V）所提取的供试品溶液，杂质峰相对减少，故选择盐酸-甲醇（1∶100，V/V）作为供试品溶液的提取溶剂。提取方法考察了超声、回流及振摇提取，结果超声提取和回流提取含量高，但无显著差异，超声提取简便，故提取方法选择超声提取。同时考察了提取时间（0，15，30，45 min）对成分溶出速率的影响，结果表明，超声处理45 min的含量并无显著变化。故最终确定文中的供试品溶液制备方法。

3.3 检测波长选择

采用紫外分光光度计全扫描，盐酸小檗碱在227mm和265nm波长处均有最大吸收，但溶剂盐酸-甲醇（1∶100，V/V）在227 nm波长处也有一定吸收，而在265 nm波长处无吸收，故最终选择265 nm处作为检测波长。