不同营养条件对微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生长和油脂积累的影响

潘孝妍，陈长鸿，王秀海，曹 猛，刘平怀

(海南大学 化学工程与技术学院，海口 570228)

化石能源的枯竭及其所带来的环境问题迫使人们研究、开发新的可再生能源。生物柴油以其可再生性而得到世界的广泛关注[1]。与传统的陆生油料植物相比，微藻具有光合作用效率高、环境适应能力强、培养周期短、油脂产量高、产生高附加值产物、不占用耕地、可用废水进行培养等优点[2]。因此，利用微藻生产生物柴油具有潜在的应用价值。然而，自然环境中的微藻生长速度缓慢，油脂产量较低，因此研究微藻生长的环境条件对提高微藻生长速率、实现高密度培养至关重要。

氮和磷是生物体合成蛋白质和核酸的基本成分，是调控植物生长发育的重要因子之一[3]。何思思等[4]研究发现，在高氮浓度下，魏氏真眼点藻的生物量最高，而在低氮浓度下，油脂含量最高。江怀真等[5]研究发现，低氮浓度和低磷浓度条件可以促进小球藻油脂的积累。碳是微藻细胞骨架的主要构成元素，可占微藻细胞干重的50%[6]。Shakya等[7]研究表明，在较高温度下，碳酸钠可以提高含高碳水化合物藻类的油脂含量。钙被公认为是植物的第二营养要素，是构成细胞膜的主要成分，对碳水化合物的形成与转化有重要的影响[8]。张森等[9]研究发现，降低钙浓度可以促进微藻Desmodesmussp.WC08生长和油脂的积累。此外，铁[10]、温度、光照和盐[11]等也对微藻生长和油脂积累产生一定的影响。

本研究选择微藻Ankistrodesmussp.CJ09为研究对象，基于BG11培养基，通过单因素实验初步考察不同质量浓度的硝酸钠、磷酸氢二钾、碳酸钠和二水氯化钙对微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长和油脂积累的影响，为微藻的高密度培养和工程微藻的构建提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

微藻Ankistrodesmussp.CJ09，由海南大学生物工程综合实验室提供。氯仿、甲醇、硝酸钠、碳酸钠、磷酸氢二钾和二水氯化钙，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

赛福智能人工气候箱，柱状玻璃管(高60 cm，直径6 cm)，TU-1810紫外可见分光光度计，LDJ-25C真空冷冻干燥机，3H12RI高速冷冻离心机，SY-1000E 多用途恒温超声提取机。

1.2 实验方法

1.2.1 BG11培养基配方

1.5 g/L NaNO3，0.04 g/L K2HPO4，0.075 g/L MgSO4·7H2O，0.036 g/L CaCl2·2H2O,0.006 g/L柠檬酸，0.006 g/L柠檬酸铁铵，0.001 g/L EDTA·Na2，0.02 g/L Na2CO3，2.86 g/L H3BO3，1.18 g/L MnCl2·4H2O，0.222 g/L ZnSO4·7 H2O，0.39 g/L NaMoO4·2H2O，0.079 g/L CuSO4· H2O，0.049 4 g/L CO(NO3)2·6H2O。

1.2.2 培养方法

实验采用柱状玻璃管进行培养，装液量为0.7 L，接种比例1∶10(体积比)，光照周期D∶L=12∶12，光照强度8 000 lx。pH 7.0±0.2，培养温度(27±2)℃，通入无菌空气，通气量为40 L/h。以BG11为基础培养基，设定质量浓度分别为0、0.75、1.50、2.25、3.00、3.75 g/L的NaNO3为氮源，其他成分均不变。质量浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L的K2HPO4为磷源，其他成分均不变。质量浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L的Na2CO3为碳源，其他成分均不变。质量浓度分别为0、0.009、0.018、0.036、0.054、0.072 g/L的CaCl2·2H2O为钙源，其他成分均不变。每组质量浓度各做3组平行。 培养过程中，每隔24 h取样，通过紫外分光光度计测定其OD680，培养时间15 d。

1.2.3 生物量的测定

培养15 d结束后，收集藻液，在8 000 r/min离心3 min，所得藻泥用去离子水洗涤3次以去除无机盐。然后将收获的藻泥冷冻干燥，保存在-20℃冰箱中备用。生物量按下式计算。

P=M/V

式中：P为生物量，g/L；M为干燥微藻的质量，g；V为培养液的体积，L。

1.2.4 油脂含量和油脂产量的测定

参照Luyen等[12]的方法(略有修改)对总脂进行提取和测定。称取一定量的藻粉，加入氯仿-甲醇-水(体积比1∶2∶0.8)，超声提取，离心后取上清，重复提取至藻粉灰白。合并上清液，加入氯仿和水至氯仿与甲醇、水三者体积比为1∶1∶0.9，离心，取下层置于干净玻璃瓶中，氮吹仪吹干至恒重。微藻的油脂含量和油脂产量按下式计算。

油脂含量=油脂质量/微藻干重×100%

油脂产量=油脂含量×微藻生物量

1.2.5 数据处理与分析

结果以“平均值±标准差”表示，数据统计分析采用SPSS Statistics 20.0和ANOVA(p<0.05)进行分析，制图采用Origine Pro 9.0软件。

2 结果与分析

2.1 NaNO3对微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生长和油脂积累的影响

微藻Ankistrodesmussp.CJ09在不同质量浓度NaNO3中的生长曲线见图1。

图1 微藻Ankistrodesmus sp.CJ09在不同质量浓度NaNO3中的生长曲线

由图1可以看出，整体上NaNO3质量浓度为0.75 g/L时，微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长最快，其次是1.50 g/L(原培养基质量浓度)，NaNO3质量浓度超过1.50 g/L时，微藻生长较未添加NaNO3的对照组的慢。

培养15 d后，测定不同NaNO3质量浓度下微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长及油脂积累情况，结果见表1。

表1 培养15 d后不同NaNO3质量浓度下微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生长及油脂积累情况

注：表中每列不同字母表示差异显著(p<0.05)。下同。

由表1可以看出，培养15 d后，微藻Ankistrodesmussp.CJ09的生物量在NaNO3质量浓度为0.75 g/L达到最高，为(1.67±0.12)g/L，是空白对照组的1.45倍。NaNO3质量浓度为3.75 g/L时，生物量最低，为(0.98±0.10)g/L。当NaNO3质量浓度为0.75 g/L时，油脂含量和油脂产量达到最高，分别为(31.49±0.55)%和(0.53±0.009)g/L，高于原培养基质量浓度(1.50 g/L)的。之后随NaNO3质量浓度升高，油脂含量和油脂产量整体降低，说明微藻Ankistrodesmussp.CJ09在低氮浓度培养条件下有利于油脂的积累，原因可能是由于氮是构成蛋白质和核酸的主要成分，而在氮限制的条件下，合成蛋白质和核酸减少，而大量合成油脂，从而导致油脂含量升高[13]。有研究表明，氮限制有利于油脂的积累[14]，本研究的结果与其一致。由此可见，NaNO3质量浓度为0.75 g/L最有利于微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长和油脂积累。

2.2 K2HPO4对微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生长和油脂积累的影响

微藻Ankistrodesmussp.CJ09在不同质量浓度K2HPO4中的生长曲线见图2。

由图2可以看出，在最初7 d的培养过程中，各组生长差异较小，培养7 d后，K2HPO4质量浓度分别为0.04 g/L(原培养基质量浓度)和0.02 g/L的微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长较快，K2HPO4质量浓度分别为0.06、0.08、0.10 g/L时，微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长较为缓慢，可能是由于磷浓度过高，使得氮磷比例失调，导致藻细胞生长繁殖受到磷的限制[15]。空白对照组在7 d后开始生长缓慢，可能是由于磷源不足，限制了微藻的繁殖生长。

图2 微藻Ankistrodesmus sp.CJ09在不同质量浓度K2HPO4中的生长曲线

培养15 d后，测定不同K2HPO4质量浓度下微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长及油脂积累情况，结果见表2。

表2 培养15 d后不同K2HPO4质量浓度下微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生长及油脂积累情况

由表2可以看出，培养15 d后，微藻Ankistrodesmussp.CJ09的生物量在K2HPO4质量浓度为0.04 g/L时最高，为(2.14±0.11)g/L，与0.02、0.06、0.08 g/L组无显著差异(p>0.05)，但显著高于0.10 g/L组(p<0.05)。不同质量浓度的K2HPO4对微藻Ankistrodesmussp.CJ09油脂含量和油脂产量影响显著(p<0.05)。当K2HPO4质量浓度为0.02 g/L时，藻细胞内油脂含量最高，为(28.91±0.42)%，与各组之间具有显著性差异(p<0.05)。而空白对照组油脂含量最低，为(17.66±0.48)%。说明一定量的磷有利于油脂的积累。K2HPO4质量浓度为0.02 g/L时，藻细胞油脂产量最高，为(0.61±0.009)g/L，可以得出，K2HPO4质量浓度为0.02 g/L时，生物量与0.04 g/L组无显著差异，但可以获得最高的油脂含量和油脂产量。

磷对微藻油脂积累的影响因藻种而异，许多微藻在磷限制条件下可以大量积累油脂，如鲁兹巴夫藻、角毛藻和三角褐指藻。但有部分微藻在磷限制条件下油脂含量减少，如微绿球藻和融合微藻[16]。本研究结果表明，降低K2HPO4质量浓度可以促进微藻Ankistrodesmussp.CJ09油脂的积累。微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长和油脂积累最适的K2HPO4质量浓度为0.02 g/L。

2.3 Na2CO3对微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生长和油脂积累的影响

微藻Ankistrodesmussp.CJ09在不同质量浓度的Na2CO3中的生长曲线见图3。

图3 微藻Ankistrodesmus sp.CJ09在不同质量浓度的Na2CO3中的生长曲线

由图3可知，在最初6 d的培养过程中，各组生长差异不明显，培养6 d后，Na2CO3质量浓度为0.08 g/L时，微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长最快。超过此质量浓度，微藻细胞的生长繁殖受到抑制，原因可能是Na2CO3质量浓度过高，导致pH升高，使微藻生长缓慢[17]。

培养15 d后，测定不同Na2CO3质量浓度下的微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长及油脂积累情况，结果见表3。

表3 培养15 d后不同Na2CO3质量浓度下微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生长及油脂积累情况

由表3可以看出，培养15 d后，微藻Ankistrodesmussp.CJ09的生物量在Na2CO3质量浓度为0.08 g/L后，达到最高，为(2.29±0.16)g/L。不同质量浓度的Na2CO3对微藻油脂含量和油脂产量的影响显著(p<0.05)，当Na2CO3质量浓度为0.10 g/L时，微藻油脂含量最高，为(30.31±0.76)%，Na2CO3质量浓度为0.08 g/L时，藻细胞油脂产量最高，为(0.68±0.007)g/L。综上，适量地添加碳源，能够明显促进微藻Ankistrodesmussp.CJ09的生长和油脂积累，与李爱芬等[18]报道的添加适量无机碳能促进藻类的生长和油脂积累结果一致。当Na2CO3质量浓度为0.08 g/L时，微藻Ankistrodesmussp.CJ09既能获得较高的生物量，又可以获得最高的油脂产量。由此可见，Na2CO3质量浓度为0.08 g/L是微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长和油脂积累的最佳质量浓度。

2.4 CaCl2·2H2O对微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生长和油脂积累的影响

微藻Ankistrodesmussp.CJ09在不同质量浓度CaCl2·2H2O中的生长曲线见图4。

图4 微藻Ankistrodesmus sp.CJ09在不同质量浓度CaCl2·2H2O中的生长曲线

由图4可知，在培养过程中，随着CaCl2·2H2O质量浓度的增加，微藻Ankistrodesmussp.CJ09的生物量呈现出先升高后降低的趋势。

培养15 d后，不同CaCl2·2H2O质量浓度下微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长及油脂积累情况见表4。

表4 培养15 d后不同CaCl2·2H2O质量浓度下微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生长及油脂积累情况

由表4可知，培养15 d后，当CaCl2·2H2O质量浓度为0.018 g/L时，微藻Ankistrodesmussp.CJ09的生物量最高，为(2.53±0.18)g/L，是空白对照组的1.35倍，0.036 g/L组次之，两者之间具有显著性差异(p<0.05)，CaCl2·2H2O质量浓度为0.072 g/L时，生物量最低，为(1.67±0.07)g/L，说明过高或过低的钙浓度都不利于微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长。不同质量浓度的CaCl2·2H2O对油脂含量和油脂产量的影响显著(p<0.05)，当CaCl2·2H2O质量浓度为0.018 g/L时，微藻Ankistrodesmussp.CJ09油脂含量和油脂产量最高，分别为(30.89±1.54)%和(0.78±0.039)g/L，显著高于其他组(p<0.05)。CaCl2·2H2O质量浓度为0.072 g/L，油脂含量和油脂产量最低，分别为(20.55±0.29)%和(0.34±0.005)g/L。因此，微藻Ankistrodesmussp.CJ09细胞生长和油脂积累的最佳CaCl2·2H2O质量浓度为0.018 g/L。在钙限制条件下，微藻Ankistrodesmussp.CJ09油脂含量增加，与文献[19]报道的钙限制有利于油脂积累的结果一致。有研究表明，钙限制导致油脂升高的原因可能是在钙限制的条件下，藻细胞生长缓慢，合成其他物质减少，光合作用产物基本都用于合成油脂[20]。

3 结 论

本实验以BG11为基础培养基，通过单因素实验，研究了培养基中不同质量浓度的NaNO3、K2HPO4、Na2CO3和CaCl2·2H2O对微藻Ankistrodesmussp.CJ09生长和油脂积累的影响，确定了培养基中氮盐(NaNO3)、磷酸盐(K2HPO4)、碳酸盐(Na2CO3)和钙盐(CaCl2·2H2O)的最佳质量浓度分别为0.75、0.02、0.08 g/L和0.018 g/L。