甘油二酯对高胆固醇血症大鼠血脂及体成分的影响

2020-04-10罗佳宪朱惠莲王永华

中国油脂 2020年3期

罗佳宪，邹琼，朱惠莲，杨博，王永华,4

(1.华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006； 2.广东粤膳特医营养科技有限公司，广东佛山 528000；3.中山大学公共卫生学院，广州 510080； 4.华南理工大学食品科学与工程学院，广州 510641)

《中国心血管病报告2018》指出，我国现有心血管疾病患者约2.9亿，心血管病是导致死亡的最主要原因[1]，而高脂血症是导致心血管疾病的主要原因之一,是动脉粥样硬化最主要的危险因素[2]。研究显示，通过对高脂血症，特别是高胆固醇血症的预防和治疗，可以明显降低心血管疾病的发病率和死亡率[3]。临床治疗上采用西药的疗效比较显著，但长时间使用存在一定副作用，会给机体带来不良反应。如何有效地通过饮食干预降低高胆固醇血症的发病率是当代人们研究的热点。

甘油二酯(DAG)作为一种功能性脂质，从2000年以来就被广泛地研究。DAG是由两分子脂肪酸与甘油酯化得到的产物，属于油脂的天然成分[4]。DAG有1,3-DAG和1,2-DAG两种异构体，在多数天然油脂和人造DAG中主要以1,3-DAG形式存在(1,3-DAG与1,2-DAG比例为7∶3)[5]。一系列的动物实验与人体实验证明了浓度大于27.3%的DAG具有降低餐后甘油三酯[6-7]、提高脂肪酸的β-氧化[8-9]、降低体重[10-11]等作用。本文建立了高胆固醇血症大鼠模型，研究DAG对其血脂及体成分的影响，旨在为DAG的进一步研究及利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及试剂

SPF级健康成年雄性SD大鼠36只，体重(200±20)g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号[SYXK(粤)2017-0080]。实验动物在室温20～25℃、湿度40%～70%的动物房内饲养，适应性喂养1周，实验期间自由摄食和饮水。DAG(1,3-DAG 与1,2-DAG比例7∶3)，广东粤膳特医营养科技有限公司提供。戊巴比妥钠，广州顾得生物科技有限公司；4%甲醛，北京索莱宝科技有限公司；生理盐水等。

1.1.2 动物饲料

普通饲料，AIN-93标准饲料；普通高脂饲料、大豆油高脂饲料、DAG高脂饲料，在普通饲料的基础上配制。饲料配方见表1。

表1 大鼠饲料的配方 %

所有饲料委托江苏美迪森生物医药有限公司加工成条状后，小包独立包装，真空密封，经60Co辐照灭菌后保存于实验室4℃冷库中，使用前取出。

1.1.3 主要实验仪器

罗氏Cobas8000 C702全自动生化仪，Discovery ASY-00409直接数字化双能X线骨密度仪(美国Hologic公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 高胆固醇血症大鼠模型的建立

在本实验室条件下给大鼠喂饲普通饲料适应1周后，按体重随机分成2组，即对照组(n=12)和模型组(n=24)，两组大鼠分别饲喂普通饲料和普通高脂饲料30 d。

1.2.2 干预实验

将高胆固醇血症大鼠按照血清总胆固醇水平随机分为2组，即TAG组、DAG组，每组12只，分别饲喂大豆油高脂饲料和DAG高脂饲料30 d，建模时对照组继续喂养。

1.2.3 评价指标的检测

1.2.3.1 一般情况

喂养期间每日观察动物外观(毛发色泽、光亮度、稀疏程度)、神态(精神状态、意识状态、反应灵敏度)、活动、食欲等一般情况，记录饲料摄入情况。每周测量(禁食12 h后)各组大鼠空腹体重、身长。

1.2.3.2 体成分测定

干预实验结束后将大鼠禁食8.5 h，先注射3%的戊巴比妥钠将动物麻醉(用量0.1 mL/100 g，约30 mg/kg)，再用细绳将大鼠四肢固定于水平放置的泡沫板上，采用双能X线吸收法[12]测量大鼠骨密度及体脂率。

1.2.3.3 血样采集及分析

大鼠体成分测定结束后恢复饮食4 h，再禁食9 h，采用股动脉采血方式每只大鼠采血约10 mL。血液标本放置30 min后，4℃、3 000 r/min离心15 min，分离出血清并在4℃冰箱保存待测。

大鼠血脂4项指标(总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C))采用全自动生化仪[13-14]进行检测。

1.2.3.4 组织病理切片观察

干预实验结束后取大鼠肝脏，将肝组织固定后，生理盐水冲洗，经脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、脱水、HE染色、封片后在显微镜下观察。

1.3 数据处理及统计

2 结果与讨论

2.1 高胆固醇血症大鼠模型的建立

2.1.1 建模期间大鼠体重的变化(见表2)

表2 建模期间大鼠体重的变化 g

注：W0、W1、W2、W3、W4分别表示建模分组时、第一周末、第二周末、第三周末和第30天的体重；a.与对照组相比P<0.05。

由表2可见，两组大鼠体重均随着喂养时间的延长而增加，且两组相同喂养时间的体重除第一周末外差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.1.2 建模结束时大鼠血脂4项指标的比较(见表3)

表3 建模结束时两组大鼠血脂指标比较 mmol/L

组别 TCTGHDL-CLDL-C对照组1.65±0.331.07±0.271.33±0.230.23±0.08模型组4.70±1.60a0.78±0.28b1.19±0.254.24±1.83a

注：a.与对照组比较P<0.01；b.与对照组比较P<0.05。

由表3可见，建模结束时，模型组TC、LDL-C含量明显高于对照组(P<0.01)，HDL-C含量差异在两组间无统计学意义。表明普通高脂饲料喂养30 d，大鼠血脂水平显著升高，形成了高胆固醇血症。另外，模型组TG明显低于对照组(P<0.05)，原因是建模饲料配方中缺乏高糖成分[15]。

2.2 干预实验期间大鼠评价指标的变化

2.2.1 大鼠体重及饲料利用率(见表4、表5)

由表4可见，在干预实验期间，各组大鼠体重均随着喂养时间的延长而增加，但各组间相同喂养时间的体重差异均无统计学意义(P>0.05)。

表4 干预实验期间大鼠体重的变化 g

注：W0、W1、W2、W3、W4分别表示干预实验分组时、第一周末、第二周末、第三周末和第30天的体重。

表5 干预实验期间大鼠饲料利用率 %

注：饲料利用率=体重增长量/饲料消耗量×100%；a.与对照组比较P<0.01;b.与TAG组比较P<0.05。

由表5可见：干预2周时,DAG组饲料利用率明显高于TAG组和对照组；干预3周时，TAG组饲料利用率高于对照组与DAG组(P<0.05)；干预30 d时，TAG组和DAG组饲料利用率无显著差异(P>0.05)，但均低于对照组(P<0.05)。

2.2.2 大鼠身长(见图1)

由图1可以看出：干预1周和2周时，TAG组大鼠的身长大于其余组别(P<0.05);干预实验结束后，TAG组和DAG组大鼠身长均大于对照组(P<0.05)。

注：干预0周表示建模完成时；a.与对照组比较P<0.05;b.与TAG组比较P<0.01。

图1 干预实验期间大鼠身长的变化

2.2.3 大鼠骨密度

干预实验结束后，通过双能X线骨密度仪检测大鼠骨密度，结果如图2所示。

由图2可见，DAG组和TAG组之间大鼠骨密度无明显差异(P>0.05)，与对照组比较，DAG组和TAG组骨密度降低(P<0.05)。

注：a.与对照组比较P<0.05。

2.2.4 大鼠体脂率

干预实验结束后，由双能X线吸收法测得大鼠体脂率的数据见表6。

表6 大鼠体脂率的变化

由表6可见，DAG组大鼠相比于TAG组和对照组，体脂率有所下降，但差异不显著(P>0.05)。

2.2.5 大鼠血脂4项指标

干预实验结束后，采用全自动生化仪检测大鼠血脂4项指标，结果见表7。

表7 大鼠血脂4项指标检测结果 mmol/L

注：a.与对照组相比P<0.05；b.与TAG组相比P<0.05。

由表7可见，DAG组HDL-C含量显著高于TAG组(P<0.05)，TC、TG和LDL-C含量与TAG组差异无统计学意义。说明与TAG相比，DAG使高胆固醇血症大鼠的血清HDL-C明显升高(P<0.05)。

2.2.6 大鼠肝脏的形态

各组大鼠肝脏切片HE染色结果见图3。由图3可见：正常对照组大鼠肝细胞质地较紧密，有条索状结构，无其他异常变化；TAG组大鼠肝组织细胞坏死严重，胞核固缩、碎裂，胞质被破坏，细胞脂肪化严重，存在大量脂肪空泡，脂质充积于胞质，正常细胞结构被破坏；与TAG组相比，DAG组大鼠肝细胞受损情况及脂肪化程度有明显好转，结构基本恢复正常，未见大空泡样变性。

图3 各组大鼠肝脏切片HE染色图像(×200)

2.3 讨论

本研究采用由猪油、胆固醇和胆酸钠等成分构成的高脂饲料配方构建高胆固醇血症大鼠模型。高脂饲料喂养30 d，模型组大鼠血清中TC、LDL-C含量均有明显升高，HDL-C含量降低，表明喂食该配方的高胆固醇饲料可成功建立高胆固醇血症模型。模型组大鼠血清中TG不升反降，表明该模型比较适用于单纯性高胆固醇血症的研究中，而不适用于高三酰甘油血症研究。另外，从大鼠的体重变化来看，本实验采用的高脂饲料对大鼠体重的影响并不强于普通饲料，高脂模型与肥胖模型有不同定义，血脂变化与体重变化无直接相关性。

模型构建成功后，将其分成了TAG组和DAG组，其中TAG组的高脂饲料中猪油成分替换成大豆油，以保证和DAG组饲料中脂肪酸比例相同(DAG是以一级大豆油为原料，经生物酶法加工工艺得到的新型健康食用油)，DAG组饲料则用DAG全部替换大豆油。各组大鼠喂养30 d，检测各组大鼠体成分、血脂水平及肝脏切片病理形态变化。结果显示：高大豆油和DAG饮食会影响大鼠的骨密度；DAG组大鼠HDL-C含量显著高于TAG组(P<0.05)，血清中HDL-C含量与冠心病和动脉硬化的发生和发展呈负相关，显著增加HDL-C的水平表明DAG在抑制体脂积累和预防心血管疾病方面具有一定的应用潜力；持续喂食高脂、高胆固醇的饲料使TAG组大鼠出现了大量的大型脂肪空泡，而DAG膳食可以减少由高脂、高胆固醇饲料引起的大鼠肝脏中脂质的蓄积。需要指出的是，如果在疾病模型中探讨DAG降低体脂、优化血脂的生理功能，建议延长DAG干预时间。为了进一步探讨DAG对人体高胆固醇血症的影响，尚需进一步开展大样本人群的临床流行病学研究。