改良QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法检测植物油中的10种植物生长调节剂

何晓明，沈雄雅，赵月钧，叶冰洁，章舒祺

(1.绿城农科检测技术有限公司，杭州 310052； 2.丽水蓝城农科检测技术有限公司，浙江 丽水 323000)

植物生长调节剂(Plant growth regulators，PGRs)是一种与天然植物激素功能相似，具有促进植物生长、提高作物品质的人工合成化合物，广泛应用于油料作物生产中，如6-苄基腺嘌呤在油菜，2，4-二氯苯氧乙酸在大豆，多效唑、烯效唑在花生生产中均已普遍使用[1-3]。随着PGRs使用的日益增多，其安全性也越来越受到重视。研究表明，残留在植物中的PGRs可通过食物链对人体健康产生危害[4-5]。但目前我国PGRs的研究大多针对蔬菜、瓜果等初级农产品，对于油料作物，特别是植物油的限量制定方面还不完善，GB 2763—2016《食品中农药最大残留限量》中仅规定了菜籽油中的多效唑限量为0.5 mg/kg，没有包含6-苄基腺嘌呤、2，4-二氯苯氧乙酸、烯效唑等常见PGRs。

植物油中农药残留检测的难点在于其高含量的油脂成分所带来的基质效应，如果样品净化不充分容易对分析造成干扰，还会污染仪器，降低仪器使用寿命。传统的提取净化方法主要是固相萃取法[6-7]和凝胶色谱法[8-9]，虽能获得较好的净化效果，但存在操作烦琐、处理时间长、成本高的问题。QuEChERS方法由于快速、简单、廉价、高效、耐用、安全的特点，在植物油农药残留检测中的应用日趋增多[10-11]，但传统的QuEChERS方法主要针对蔬菜、水果等含水量多、基质干扰少的样品，应用于高脂肪含量样品时，选择性不够高，净化效果不理想，对检测结果的精密度和准确度产生影响[12]。

本实验采用改良的QuEChERS方法，结合高效液相色谱-串联质谱法用于植物油中10种PGRs的测定，以期为监管部门制定相关限量标准提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

市售植物油。甲酸、乙腈和甲醇(HPLC级，美国Thermo公司)；增强型基质去除吸附剂(EMR-Lipid，美国Agilent公司)；十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)，N-丙基乙二胺(PSA)(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；实验用水为Milli-Q超纯水；其他试剂均为分析纯。10种PGRs标准品，即6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2，4-二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸、氯吡脲、多效唑、噻苯隆、4-氟苯氧乙酸和异戊烯腺嘌呤，纯度均大于95%，购于Dr.Ehrenstorfer公司。

1.1.2 仪器与设备

LC-MS 8050三重四级杆液相色谱-串联质谱仪(日本Shimadzu公司)；DMT-2500多管涡旋混合仪(杭州米欧仪器有限公司)；ST16R高速冷冻离心机(美国Thermo公司)；超纯水机(美国Millipore公司)；KQ-500E超声波清洗器(500 W)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

分别称取10种PGRs标准品，用甲醇定容，配制成100 mg/L的标准储备液，4℃下避光保存。用时根据需要用空白基质提取液逐级稀释配成适当浓度的混合标准工作液。

1.2.2 样品前处理

称取2.00 g植物油样品于50 mL离心管中，加入10 mL 1%(体积分数，下同)甲酸-乙腈溶液，超声提取10 min，8 000 r/min离心3 min，上清液待净化。移取4 mL上清液至装有0.5 g EMR-Lipid净化管中(使用前用2 mL水充分润湿活化)，涡旋2 min，8 000 r/min离心3 min，取净化液至已提前加入0.5 g氯化钠和1.0 g无水硫酸镁的10 mL离心管中，涡旋1 min，8 000 r/min离心3 min，将净化液移入10 mL离心管中，40℃下氮吹至干，加入1.0 mL 10%甲醇水溶液复溶，过0.22 μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.3 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；进样量3 μL；柱温30℃；流动相为0.1%甲酸-2 mmol/L甲酸铵水溶液(A)和甲醇(B)；流速0.3 mL/min；采用梯度洗脱，洗脱程序为0～0.5 min 10% B,0.5～1.5 min 10%～30% B,1.5～5.5 min 30%～70% B，5.5～6.5 min 70% B，6.5～7.5 min 70%～10% B。

1.2.4 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)温度400℃，毛细管电压4 000 V；扫描方式为正、负离子模式；雾化气流量3.0 L/min；加热气流量10.0 L/min；定性与定量离子对、碰撞能量等参数见表1。

1.2.5 数据分析

采用SPSS 20软件进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

采用电喷雾离子源，在正、负离子扫描模式下对10种PGRs的单一标准溶液进行母离子全扫描，再对其子离子全扫描。参照欧盟EU第2002/657/EC号决议中的有关规定[13]，每个目标物选择2对响应值较高的特征离子对作为定量及定性离子化，最后以多反应监测模式优化各种质谱参数，相关参数见表1。

表1 10种PGRs的质谱参数

注：*为定量离子。

2.2 色谱条件的优化

流动相的选择对目标物的离子化及质谱检测的灵敏度有一定作用。结合文献报道[2,14-15]，分别以甲醇、乙腈作为有机相，0.1%甲酸-2 mmol/L甲酸铵、0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸铵、0.5%甲酸-2 mmol/L甲酸铵和0.5%甲酸-5 mmol/L甲酸铵作为水相，比较了不同流动相下的分离效果。结果表明，采用甲醇作为有机相时，分离效果好于乙腈；水相中加入0.1%甲酸时，10种PGRs峰形和灵敏度均较好，而加入0.5%甲酸时，吲哚乙酸、吲哚丁酸、氯吡脲和多效唑的响应值明显上升，但系统中酸含量增加，降低了负离子扫描下6-苄基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸、噻苯隆、4-氟苯氧乙酸和异戊烯腺嘌呤的响应强度。对比了0.1%甲酸-2 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸铵作为水相时的分离效果，结果发现，使用0.1%甲酸-2 mmol/L甲酸铵时分离度和重复性更好。因此，选择0.1%甲酸-2 mmol/L甲酸铵与甲醇作为流动相。10种PGRs的总离子流色谱图见图1。

注：1.异戊烯腺嘌呤；2.6-苄基腺嘌呤；3.吲哚乙酸；4.4-氟苯氧乙酸；5.噻苯隆；6.4-氯苯氧乙酸；7.吲哚丁酸；8.氯吡脲；9.2,4-二氯苯氧乙酸；10.多效唑。

图1 高效液相色谱-串联质谱测定10种PGRs标准溶液(10 μg/L)的总离子流色谱图

2.3 前处理方法的优化

2.3.1 提取溶剂的优化

目前QuEChERS方法提取溶剂大多采用甲醇或乙腈，以及酸性的甲醇或乙腈[16]。以10种PGRs添加水平为5 μg/kg的植物油样品为实验材料，分别比较了甲醇、乙腈、1%甲酸-甲醇溶液、1%甲酸-乙腈溶液对10种PGRs回收率的影响，结果见图2。

图2 不同提取溶剂对10种PGRs提取效果的影响

从图2可以看出，甲醇和酸性甲醇的基质效应较大而导致回收率偏低，酸性乙腈的提取效果最好。这可能因为用甲醇提取时植物油中的杂质随着目标物一起被提取出来，对检测结果产生影响[17]。此外，PGRs属于酸性化合物，在乙腈中添加适量的甲酸可以抑制PGRs在溶液中电离成离子形态，提高提取效率。因此，选择1%甲酸-乙腈溶液作为提取溶剂。

2.3.2 提取方法的优化

以10种PGRs添加水平为5 μg/kg的植物油样品为实验材料，考察了振荡提取(2 000 r/min，40℃)与超声提取(200 W，40℃)两种方法的回收率，结果见图3。

图3 不同提取方法对10种PGRs提取效果的影响

从图3可以看出，10种PGRs经振荡提取后回收率在65.3%～77.1%，超声提取后10种PGRs回收率上升至84.9%～90.7%。

进一步比较了不同的超声时间(5、10、20、30 min)对10种PGRs回收率的影响。结果显示，回收率随着超声时间的延长而增加，在10 min时趋于平衡，继续延长超声时间，回收率基本不变。因此，选择超声时间10 min。

2.3.3 净化方法的优化

植物油样品中主要的基质干扰为脂类物质，其会干扰目标物的测定，因此选择合适的吸附剂除去脂类干扰成为QuEChERS方法的关键。对传统QuEChERS方法中常用的吸附剂C18、PSA和增强型基质去除吸附剂EMR-Lipid进行考察。取1 mL空白植物油提取液分别加入0.5 g EMR-Lipid、0.5 g C18和0.5 g PSA，得到净化后基质溶液，以基质效应(ME)评价3种吸附剂对10种PGRs的净化效果。ME=基质空白加标溶液响应值/空白溶剂中加标溶液响应值×100%。ME值越高,表示经净化后目标物信号越强，基质干扰越低，净化效果越理想。3种吸附剂对10种PGRs净化效果的影响见图4。

图4 不同吸附剂对10种PGRs净化效果的影响

由图4可以看出：传统吸附剂C18、PSA对高油脂样品净化效果不理想，净化液较混浊，10种PGRs的ME值均低于80%；采用EMR-Lipid净化效果最好，10种PGRs的ME值在82.1%～90.3%之间，基质干扰小，加标样品的分离度和峰形均较好。这可能是与硅胶基质为主键合C18、PSA等吸附剂相比，特殊聚合物基质EMR-Lipid能够专门吸附C5及以上的长链脂类，选择吸附性好，可以获得理想的除脂净化效果[18-19]。

PGRs在植物油中以痕量存在，加大样品浓缩倍数是提高方法灵敏度的有效手段，但由于吸附剂吸附能力有限，样品净化量过大则会影响净化效果。实验考察了不同样品净化量(1、2、4、6、8 mL)对PGRs净化效果的影响，发现样品净化量超过4 mL时，吲哚丁酸、氯吡脲、异戊烯腺嘌呤的回收率有不同程度的下降，这可能是未被消除的杂质所造成的基质效应。因此，选择4 mL提取液进行EMR-Lipid净化。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线、检出限与定量限

由2.3.3结果可知，在经过QuEChERS净化处理后仍存在一定的基质效应，因此采用基质匹配工作标准曲线作为校正曲线，以消除基质效应带来的偏差。用空白植物油样品提取液作为溶液配制标准工作曲线溶液，按1.2.3、1.2.4方法进行测定，以定量离子的峰面积为纵坐标，以相应溶液的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，在最低添加水平下，以3倍信噪比确定方法检出限，以10倍信噪比确定方法定量限，结果见表2。由表2可知，在1～100 μg/L范围内，10种PGRs线性关系良好，相关系数(r)为0.991～0.998，检出限为0.014～0.188 μg/kg，定量限为0.048～0.625 μg/kg。

表2 10种PGRs的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

2.4.2 回收率与精密度

在空白菜籽油、大豆油和花生油样品中添加高、中、低3个水平的混合标准溶液，回收率与相对标准偏差(RSD)结果见表3。

表3 空白样品中10种PGRs的加标回收率和相对标准偏差(n=6)

由表3可知，在优化的实验条件下10种PGRs的回收率在70.2%～94.7%之间，RSD为1.2%～10.2%，准确度与精密度能满足实际分析的要求。

2.5 与国标方法的比较

与GB/T 20770—2008方法进行比较，本方法的优势体现在以下几个方面：①检测的植物生长调节剂种类由2种增加至10种，覆盖面更广；②对于高油脂样品的分析更具有针对性，灵敏度更高；③国标的净化方式为凝胶色谱净化，存在净化时间长、操作烦琐、有机溶剂使用量大的问题，本方法直接通过QuEChERS方法净化，所用的试剂少、简单、易于操作。

2.6 实际样品的测定

采用本方法对30批次市售菜籽油、大豆油和花生油进行测定。检测结果表明，上述10种PGRs均未检出。考虑到此次被检样品来自于大型超市品牌厂家生产，而植物油生产企业众多，有不少小型植物油生产企业，质量意识淡薄，有潜在的质量安全风险，所以植物油中PGRs残留问题仍需连续监测。

3 结 论

本实验将新型吸附剂EMR-Lipid应用到的QuEChERS前处理方法，并结合高效液相色谱-串联质谱法建立了同时测定植物油中10种PGRs检测方法。本方法线性范围为1～100 μg/L，10种PGRs线性关系良好，相关系数(r)为0.991～0.998。检出限为0.014～0.188 μg/kg，定量限为0.048～0.625 μg/kg。10种PGRs的回收率在70.2%～94.7%之间，RSD为1.2%～10.2%。相比于传统QuEChERS法，本方法除脂净化效果更好，可用于植物油中多种PGRs残留的快速筛查和确证，为植物油中PGRs限量的设定建立前期风险监测基础。