水酶法提取冬瓜籽油工艺优化及体外抗氧化活性研究

吕秋冰，罗 霜，杨 恒，王 敏，冯友君

(1.四川旅游学院 食品学院，成都 610100； 2.四川旅游学院 信息与工程学院，成都 610100)

冬瓜(BenincasahispidaCogn)属葫芦科一年生草本植物，全国各地均有栽培[1]。冬瓜籽来源丰富，且其中含有维生素B1、皂苷、瓜氨酸、组氨酸、蛇麻脂醇、甘露醇等活性物质，冬瓜籽仅少数用于医药，大部分被丢弃，使冬瓜加工的经济效益降低。冬瓜籽的油脂含量高达32%[2]，冬瓜籽油以不饱和脂肪酸为主，其中亚油酸含量高达48.55%[3]，具有极高的利用价值。

油脂的提取方法主要有超声波法[3]、物理压榨法[4]、溶剂浸出法[5]、水酶法等[6]。压榨法出油率较低[7]；溶剂浸出法存在化学溶剂残留[7-8]；超声波法因投入成本大，生产能力受限[9]。目前，冬瓜籽油的提取工艺研究主要集中在超声波辅助提取法[3，10-11]上，利用水酶法提取冬瓜籽油尚未有报道。水酶法是通过生物破壁方式提取油脂，条件温和，有利于保留活性物质，且操作和设备要求简单，具有高效、绿色、安全的特点。

本研究运用响应面设计优化水酶法提取冬瓜籽油工艺，并对冬瓜籽油进行体外抗氧化活性研究，为冬瓜籽油的综合应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

冬瓜籽，市售，粉碎后备用；α-淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶，购于河南庆飞食品配料有限公司；盐酸、氢氧化钠、VC、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、过氧化氢(H2O2)、七水合硫酸亚铁、水杨酸、无水乙醇、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)，均为分析纯。

DF-101S电热恒温磁力搅拌器；DFY-C-400粉碎机；H2050R高速离心机；starter3C ST2100 pH计；DGX-9243B-1恒温干燥箱；FA1104N电子分析天平；UABluestarA紫外可见分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 冬瓜籽油的提取

准确称取冬瓜籽粉10.0 g，按一定料液比加入蒸馏水，用1.0 mol/L的HCl溶液或1.0 mol/L的NaOH溶液调节pH，加入酶制剂，在一定温度下酶解一定时间，100℃加热30 min灭酶，8 500 r/min离心20 min，吸取上层清油，称重，按下式计算提取率。

提取率=W2/W1×100%

式中：W1为冬瓜籽中油的质量；W2为酶解获得冬瓜籽油的质量。

1.2.2 冬瓜籽油体外抗氧化活性研究

1.2.2.1 DPPH自由基清除能力的测定

参照文献[12]进行冬瓜籽油DPPH自由基清除能力的测定。按下式计算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1为样品溶液+DPPH溶液吸光度；A2为样品溶液+无水乙醇吸光度；A0为DPPH溶液+样品溶剂吸光度。

1.2.2.2 羟基自由基清除能力的测定

参照文献[12]进行冬瓜籽油羟基自由基清除能力的测定。按下式计算羟基自由基清除率。

羟基自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1为样品溶液+FeSO4溶液+H2O2溶液+水杨酸吸光度；A2为样品溶液+FeSO4溶液+蒸馏水+水杨酸吸光度；A0为样品溶剂+FeSO4溶液+H2O2溶液+水杨酸吸光度。

1.2.2.3 总还原力的测定

参照文献[12]进行冬瓜籽油总还原力的测定。以吸光度表示铁离子还原力大小。

2 结果与分析

2.1 水酶法提取冬瓜籽油单因素试验

2.1.1 酶种类对冬瓜籽油提取率的影响

称取10.0 g冬瓜籽粉，按料液比1∶6加蒸馏水，调节pH至各酶的最适pH，分别加入3% (以冬瓜籽粉质量计，下同)α-淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶，在各自最适温度和最适pH[10](表1)下酶解6 h。酶种类对冬瓜籽油提取率的影响见图1。

表1 各酶最适温度及pH

注：1.纤维素酶；2.中性蛋白酶；3.酸性蛋白酶；4.果胶酶；5.碱性蛋白酶；6.α-淀粉酶；7.葡聚糖酶。

图1 酶种类对冬瓜籽油提取率的影响

由图1可看出，不同酶对于冬瓜籽油提取率都有一定的影响，其中葡聚糖酶对冬瓜籽油提取率的影响最大，其次是果胶酶和α-淀粉酶，纤维素酶对冬瓜籽油提取的效果甚微。分析原因可能是葡聚糖酶可以使冬瓜籽胚乳细胞壁中的β-葡聚糖分解，细胞壁破裂，使油脂分子很好地被释放出来。因此，以葡聚糖酶作为后续试验用酶。

2.1.2 葡聚糖酶添加量对冬瓜籽油提取率的影响

称取10.0 g冬瓜籽粉，在料液比1∶6、pH 4.2下，分别加入1%、2%、3%、4%、5%葡聚糖酶，在60℃下酶解6 h，考察葡聚糖酶添加量对冬瓜籽油提取率的影响，结果见图2。

图2 葡聚糖酶添加量对冬瓜籽油提取率的影响

由图2可看出，葡聚糖酶添加量小于3%时，随着葡聚糖酶添加量的增加，冬瓜籽油提取率呈明显上升趋势，在葡聚糖酶添加量为3%时冬瓜籽油提取率达到最高，为89%，之后随葡聚糖酶添加量增大，冬瓜籽油提取率下降，可能是由于酶用量过多，使酶本身发生自溶反应。因此，最适的葡聚糖酶添加量为3%。

2.1.3 料液比对冬瓜籽油提取率的影响

称取10.0 g冬瓜籽粉，分别在料液比1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8，pH 4.2下，加入3%葡聚糖酶，在60℃下酶解6 h，考察料液比对冬瓜籽油提取率的影响，结果见图3。

图3 料液比对冬瓜籽油提取率的影响

由图3可看出，随着料液比的增加，冬瓜籽油提取率呈现升高趋势，当料液比为1∶6时冬瓜籽油提取率最高，之后随料液比增加，冬瓜籽油提取率降低。料液比较低时，体系黏度大，酶与底物不能完全接触，反应不充分，冬瓜籽油提取率较低；料液比较高时，底物浓度降低，反应接触面积虽有增大，但是酶与底物相互作用的机会降低，使酶的作用效果下降，所以在冬瓜籽油提取过程中料液比为1∶6较适宜。

2.1.4 酶解时间对冬瓜籽油提取率的影响

称取10.0 g冬瓜籽粉，在料液比1∶6、pH 4.2下加入3%葡聚糖酶，在60℃下分别酶解2、4、6、8 h，考察酶解时间对冬瓜籽油提取率的影响，结果见图4。

图4 酶解时间对冬瓜籽油提取率的影响

由图4可看出，随着酶解时间的延长，冬瓜籽油提取率先增大后降低。酶解时间较短，葡聚糖酶与底物接触时间较短，未能充分反应，导致冬瓜籽油提取率较低；随着酶解时间的延长，酶对冬瓜籽细胞壁成分逐步分解破坏，使油脂分子团充分暴露在环境中，进而有利于油脂的释放，所以冬瓜籽油提取率有所提高。但酶解时间过长，葡聚糖酶在长时间反应过程中活性降低，水与油脂形成的乳化现象也更加明显，导致冬瓜籽油提取率反而下降。因此，酶解时间选择6 h较好。

2.1.5 pH对冬瓜籽油提取率的影响

称取10.0 g冬瓜籽粉，料液比1∶6，分别调节pH为3.2、4.2、5.2、6.2，加入3%葡聚糖酶，在60℃下酶解6 h，考察pH对冬瓜籽油提取率的影响，结果见图5。

图5 pH对冬瓜籽油提取率的影响

由图5可知，随pH增大，冬瓜籽油提取率增大，在pH为4.2时，冬瓜籽油提取率最高，之后随pH增大，冬瓜籽油提取率降低。由于葡聚糖酶的最适反应pH为4.2，此时酶处在高活力状态，反应速度较快，冬瓜籽油提取率最大。因此，pH选择4.2为宜。

2.1.6 酶解温度对冬瓜籽油提取率的影响

称取10.0 g冬瓜籽粉，在料液比1∶6、pH 4.2下，加入3%葡聚糖酶，分别在40、50、60、70℃下酶解6 h，考察酶解温度对冬瓜籽油提取率的影响，结果见图6。

图6 酶解温度对冬瓜籽油提取率的影响

由图6可知：随酶解温度的升高，冬瓜籽油提取率呈现逐渐上升的趋势，60℃时，冬瓜籽油提取率最大，这是由于葡聚糖酶的最适酶解温度为60℃左右，酶处在高活力状态，反应速度提高，冬瓜籽油提取率升高；当酶解温度超过60℃后葡聚糖酶的活性降低，反应速率减弱，导致冬瓜籽油提取率下降。因此，酶解温度选择60℃为宜。

2.2 响应面优化试验

在单因素试验研究基础上，固定料液比1∶6，葡聚糖酶添加量3%，以pH(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)为影响因素，冬瓜籽油提取率(Y)为响应值，以Box-Behnken设计三因素三水平共17个试验点的响应面试验，优化水酶法提取冬瓜籽油的工艺条件，响应面试验因素水平见表2，响应面试验设计与结果见表3，方差分析见表4。

表2 响应面试验因素水平

表3 响应面试验设计与结果

续表3

试验号ABC提取率/%1401-170.34151-1072.161600091.3817-10-164.43

用Design-Expert 8.0.3对表3 中的试验数据进行回归分析后得到响应面模型方程：Y=91.09+0.35A+0.47B+0.45C+0.42AB+0.12AC-0.020BC-11.92A2-6.50B2-14.19C2。

表4 响应面试验方差分析

注:**表示P<0.01,差异极显著；*表示P≤0.05,差异显著。

通过Design-Expert 8.0.3计算出该模型下理论冬瓜籽油提取率为91.10%，其理论试验条件为pH 4.22、酶解时间6.07 h、酶解温度60.15℃。因理论试验条件不易操控，故修正试验条件为pH 4.22、酶解时间6.1 h、酶解温度60℃，在此条件下进行验证试验，得到冬瓜籽油提取率为90.67%，验证值与预测值相对误差为0.47%，二者非常接近，说明试验得到的回归模型适用于冬瓜籽油水酶法提取条件的预测。

2.3 冬瓜籽油体外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基较为稳定，当DPPH自由基与抗氧化剂反应时呈现颜色变化，其浓度与颜色深浅成正比，并在波长517 nm处有较好的吸收峰。自由基清除剂可与DPPH自由基的单电子配对，导致其在最大吸收波长处颜色变浅，吸光度也随之减小。DPPH 自由基清除率越高，表明该物质抗氧化能力越大[13]。冬瓜籽油及VC对DPPH自由基的清除能力分别见图7、图8。

图7 冬瓜籽油对DPPH自由基的清除能力

图8 VC对DPPH自由基的清除能力

由图7可知，冬瓜籽油有一定的清除DPPH自由基的能力，且随冬瓜籽油质量浓度增大，其对DPPH 自由基清除率增大，但低于VC的(见图8)。当冬瓜籽油质量浓度为10 mg/mL时，其对DPPH自由基清除率仅有49.95%，而VC质量浓度为1 mg/mL时，其对DPPH自由基清除率已达93.81%。通过SPSS 22.0计算出冬瓜籽油清除DPPH自由基的IC50为10.23 mg/mL。

2.3.2 羟基自由基的清除能力

在人体中，羟基自由基由于有极强的氧化能力，所以在羟基自由基过量的情况下，额外的羟基自由基首先会对人体细胞中糖类、氨基酸、蛋白质等大分子造成伤害，从而使细胞出现死亡或突变的现象，进一步会导致人体出现衰老、产生一系列恶性疾病的状况，羟基自由基与还原剂反应后可在波长510 nm处呈现最高波峰。以VC为对照，冬瓜籽油对羟基自由基的清除能力见图9。

图9 VC与冬瓜籽油对羟基自由基的清除能力

由图9可知，冬瓜籽油对羟基自由基清除能力随其质量浓度的增加而增大，在质量浓度小于1.0 mg/mL时，冬瓜籽油对羟基自由基清除率低VC，但在冬瓜籽油质量浓度为1.0 mg/mL时，其对羟基自由基清除率达到了98.84%，接近于相同质量浓度下VC的。通过SPSS 22.0计算出冬瓜籽油清除羟基自由基的IC50为0.39 mg/mL。比较冬瓜籽油对DPPH自由基与羟基自由基的IC50可以看到，冬瓜籽油对氧化性更强的羟基自由基有更好的清除效果。

2.3.3 总还原力(见图10、图11)

图10 冬瓜籽油总还原力

图11 VC总还原力

由图10可知，冬瓜籽油总还原力随冬瓜籽油质量浓度的增加而增大，但低于VC(见图11)。

3 结 论

采用单因素试验和响应面试验对水酶法提取冬瓜籽油工艺进行优化，得到最佳的工艺条件为：料液比1∶6，酶解时间6.1 h，葡聚糖酶添加量3%，酶解温度60℃，pH 4.22。在最佳条件下，冬瓜籽油提取率为90.67%。体外抗氧化活性结果表明：水酶法提取的冬瓜籽油对DPPH自由基和羟基自由基具有较强的清除能力，对应的IC50分别为10.23 mg/mL和0.39 mg/mL，当冬瓜籽油的质量浓度达到1.0 mg/mL时，对羟基自由基清除率达到98.84%，清除效果相当于相同质量浓度的VC，对Fe3+有一定的还原能力，且还原能力随冬瓜籽油质量浓度增大而增强。