卵巢切除手术对大鼠骨质的影响

邓 琳，冯倩倩，凌 斌★，冯定庆

（1.中日友好医院 妇产科，北京 100029；2.中国医学科学院北京协和医学院 研究生院，北京 100730）

图1 卵巢去势对大鼠腰椎骨组织结构的影响。1A：对照组腰椎，可见完整的骨小梁结构（HE×100）；1B：去势组腰椎,骨小梁断裂，出现多个游离端（HE×100）；1C：对照组骨小梁结构完整，小梁内可见绿色胶原纤维（Masson染色×100）；1D：去势组可见骨小梁断裂、间距增宽、残端游离，少见胶原纤维（Masson染色×100）。

建立动物骨质疏松模型主要有药物和去势手术， 应用卵巢去势方法建立绝经后骨质疏松模型是目前常用的研究方法[1]，动物来源一般为SD 大鼠， 但至今为止国内外对于大鼠骨质疏松模型的判定和评价标准尚不统一[2，3]。 本研究对SD 大鼠进行卵巢去势手术，测定大鼠的骨密度、骨代谢指标、动情周期和骨小梁结构，以期从多方面为大鼠骨质疏松的评判提供一些依据和参考。

1 研究方法

1.1 实验动物饲养

6月龄雌性未孕Sprague Dawley（SD）大鼠16只，体质量450±20g，购自北京华阜康实验动物中心，许可证号：scxk（京）2014-0004。动物饲养于中日友好临床医学研究所SPF 动物室， 室温22℃～26℃，湿度40%～60%，每12h 进行昼夜明暗交替，自由饮水和采食。 分笼饲养，每笼4 只大鼠，适应环境2 周后开始实验。 本研究已取得中日友好临床医学研究所动物实验伦理批件 （伦理审批号：180203）。

1.2 SD 大鼠去势模型的建立

大鼠2 周适应环境后随机分为对照组和去势组，每组8 只。 去势组：10%水合氯醛按400mg/kg腹腔注射麻醉。腹部正中切口，结扎卵巢周围血管后切除双侧卵巢，碘伏消毒，逐层缝合[4]。肌注青霉素20 万U/只。 对照组步骤同去势组， 不切除卵巢，仅切除卵巢周围同等大小的脂肪组织。

1.3 大鼠血清骨转换标志物水平测定

大鼠去势2 周后，予阴道分泌物检测，待去势组失去节律性动情周期后予血清股转换标志物检测， 每2 周检测1 次。 10%水合氯醛按400mg/kg腹腔注射麻醉，备皮并消毒心脏所在区域皮肤，触及心脏搏动最强点后固定， 垂直进针回血后抽取动脉血1ml。 消毒抽血部位皮肤并按压数秒止血。于3000rpm/min 下离心5min，收取上清，分装备用，保存于-80℃冰箱保存。 ELISA 试剂盒购自云克隆公司， 根据说明稀释血清并用酶联免疫法测定血清血清I 型原胶原氨基端前肽（procollagen type I N-terminal propeptide， PINP）、骨钙素（osteocalcin，OC） 和I 型胶原交联羧基端肽 （crosslinked carboxy-terminal telopeptide of I collagen，I-CTX）水平。

1.4 大鼠骨密度的测定

术后4周起， 每2周测量1次大鼠骨密度（bone mineral density，BMD）。 10%水合氯醛按400mg/kg 腹腔注射麻醉。 将大鼠俯卧位固定在双能X 线骨密度测量仪（dual energy X-ray absorptiometry， DXA，美国GE 公司）的扫描定位板上，用系统自带的小动物测量软件勾选目标区域后测定活体腰椎和双侧股骨的BMD。按照人骨质疏松判断标准[5]评定。

1.5 根据大鼠阴道脱落细胞观察动情周期

术后2 周起每日同一时间对去势组和对照组大鼠逐只进行阴道涂片观察。 将大鼠粪便及尿液擦净， 用沾有生理盐水的小棉签轻轻插入大鼠阴道取黏液，均匀涂在载玻片上，固定后HE 染色，中性树胶封片。 显微镜下观察。

1.6 骨组织切片染色

大鼠于去势3个月后处死， 取腰椎固定于10%福尔马林溶液中，1 周后取出，置于含硝酸的混合脱钙液中脱钙2 周。修剪组织到合适大小，标记后常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，使用多聚赖氨酸溶液浸泡过的载玻片， 切片厚5μm。 Masson 染色观察骨组织中胶原纤维水平。HE 染色观察骨小梁结构， 进行骨组织形态计量学参数的测定。应用ImageProPlus 显微测量系统，测定总组织面积（T.Ar）、骨小梁面积（Tb.Ar）和骨小梁周长（Tb.Pm）。 并用校正公式进行计算。

1.7 统计学方法

应用SPSS22.0 和GraphPadPrism 7.0 对数据进行统计分析及作图。正态分布的计量数据以±s表示，组间比较采用t 检验。

2 结果

2.1 动情周期的观测

对照组大鼠呈现规律的动情前期-动情期-动情后期-动情间期的周期变化。 动情前期 （2～3d）：多为椭圆形有核上皮细胞，偶有少量角化细胞；动情期（1～2d）：多为外形不规则的角化上皮细胞，常相互连接成片或呈“落叶状”堆积；动情后期（2～3d）：不规则角化上皮细胞，有核上皮细胞，白细胞均可见，均匀分布；动情间期（3～9d）：多为白细胞，偶有少量有核上皮细胞和少量黏液。术后第9 周起，去势组大鼠即表现为没有动情期，以动情间期为主，动情前期-动情间期交替的变化，失去正常的动情周期节律。

2.2 骨密度的测定

自术后6 周起，去势组大鼠较对照组BMD 呈降低趋势，差异无统计学意义。 术后10 周，如表1所示，去势组腰椎及股骨BMD 较对照组均降低，差异具有统计学意义（均P＜0.05），其中腰椎变化较股骨更为突出（表1）。去势组大鼠腰椎BMD 与对照组比较， 降低20.4%，＞20%（P＜0.05）； 股骨BMD 降低11%（P＜0.05），其中右侧股骨降低较左侧更显著，为12.3%（P＜0.05）左侧股骨BMD 降低10.1%。根据BMD 计算T 值，大鼠腰椎T 值-2.58，＜-2.5，已达到骨质疏松水平。 股骨T 值为-2.17，其中右侧股骨T 值为-4.95， 达到骨质疏松水平，左侧股骨T 值为-1.15，为骨量减低。

表1 对照组和去势组大鼠腰椎、股骨骨密度（g/cm2）

表2 卵巢去势对大鼠血清骨转换标志物水平的影响

2.3 骨转换指标的测定

每月测量大鼠血清PINP、OC、I-CTX的水平。 表2 示，术后3个月，去势组大鼠血清OC 的水平为529.5±19.29pg/ml，较对照组显著降低（P＜0.01）； 去势组大鼠血清I-CTX 的水平为144.1±1.44pg/ml，较对照组显著升高（P＜0.01）；大鼠血清PINP 的水平为3310±216.4pg/ml， 较对照组有所降低（P＞0.05）。

2.4 骨组织切片染色

术后3个月，处死大鼠，取腰椎切片做HE 和masson 染色（图1A～1D，封二）。 对照组骨小梁结构完整，致密，相互连接成立体网状，少见游离端，骨小梁表面光滑，间距小，且骨小梁内可见绿色的胶原纤维；去势组骨小梁结构松散，排列稀疏，骨小梁间距明显增宽，厚度减低，形态不规则，出现断裂、残端游离，连接中断，失去正常骨小梁的三维结构，亦少见绿染的胶原纤维。对照组骨小梁百分率为32.07%±1.44%， 去势组则为15.31%±0.63%，较对照组有明显减低（P＜0.01）（图2A）。对照组骨小梁厚度为68.41± 3.19μm， 与对照组（52.28±0.81μm）相比显著减低（P＜0.01）（图2B）。对照组骨小梁间距为144.5±4.74μm，去势组则为289.7±13.35μm，与对照组相比去势组骨小梁间距显著增宽，达对照组的2 倍（P＜0.01）（图2C）。

3 讨论

本实验选择6月龄SD 大鼠进行造模观察，这与国内外绝大多数研究使用的大鼠的鼠龄是一致的[6]，美国食品与药物管理局也建议研究绝经后骨质疏松动物模型选择6～10月龄雌鼠。

动情周期是反应激素水平变化的一个参考指标，去势后最早出现变化。 本研究发现，卵巢切除术后，去势组动情期逐渐缩短至消失，到术后第9周，去势组失去规律的“动情前期-动情期-动情后期-动情间期”的变化，转变为以动情间期为主，动情前期和动情间期交替的改变， 提示去势后大鼠体内激素水平可能出现紊乱。

DXA 检测BMD 是目前公认的诊断骨质疏松症的金标准，临床上推荐的测量部位是腰椎1-4、总髋部和股骨颈。 根据BMD 计算T 值来判断骨质疏松程度：-2.5＜T≤-1.0 为低骨量，T≤-2.5 为骨质疏松，BMD 每下降1个标准差骨折风险增加1.5～3.6 倍[7，8]。但是对于大鼠骨质疏松的诊断尚不明确。 目前多数研究以与对照组相比，BMD 下降10%～20%为骨质疏松模型建立成功[2，3]，且目前多数研究采用离体骨测量BMD，活体测量的案例较少。 本研究采取大鼠活体DXA 测量，发现相对于股骨， 腰椎的骨密度变化更为明显。 在术后第6周，大鼠腰椎的骨密度即出现一定的降低，到术后第10 周即有明显的下滑。 与对照组相比，去势后大鼠的腰椎BMD 下降达20%以上，T 值亦＜-2.5；而股骨的骨密度变化较腰椎变化慢，BMD 仅降低11%。 股骨和椎骨骨密度变化的不均一可能是由于皮质骨和松质骨对雌激素的敏感性不同[9，10]所致。 有研究[7，11]认为，BMD 变化速度，腰椎＞胫骨＞股骨＞胫骨上段＞股骨上段，这与本研究的结果是一致的。在研究骨质疏松及治疗效果时，以腰椎为研究对象更能敏感反映骨代谢变化和治疗疗效，腰椎BMD 下降20%可作为骨质疏松模型建立成功的一个提示指标。

图2 卵巢去势对大鼠腰椎骨组织结构的影响

骨重建是骨吸收和骨形成2个阶段不断循环往替的过程。 PINP 和OC 反映成骨细胞活力和骨形成，I-CTX 反映骨吸收情况，检测血清骨代谢指标对判断全身骨代谢水平有一定提示意义[12]。 本研究发现，卵巢去势手术后3个月，大鼠血清OC、PINP 水平较对照组明显降低，I-CTX 水平较对照组明显升高， 提示卵巢切除后大鼠体内骨吸收增多，而骨形成减少，有衍变为骨质疏松的趋势。 因此， 术后3个月可能是骨代谢指标降低的关键节点。但也有研究认为，术后8 周血清骨代谢指标即有改变，术后12 周变化更加突出[10，13]，与本研究结果存在差异， 这可能与实验用鼠鼠龄和检测方式不同有关。 本研究中去势组OC 和I-CTX 水平均出现明显变化且有统计学意义，PINP 水平较对照组有一定下降，但差异没有统计学意义，这可能是由于血清骨转换指标反映整体骨转换水平， 出现变化略晚，而本研究观察时间尚短，成骨细胞骨形成变化尚不明显。由于大鼠血量较少，取血部位及血量有所限制， 血清骨转化指标的代表性和准确性较DXA 差，故应作为骨质疏松诊断的次要参考指标。

骨组织病理切片染色也是判断骨质疏松的重要手段，能够清楚观察骨小梁结构变化。本研究于去势手术后3个月取大鼠腰椎进行组织切片染色。研究发现，卵巢去势后，大鼠骨小梁结构塌陷，与对照组相比骨小梁变细，游离残端增多，骨小梁内少有胶原纤维及新生骨； 而对照组则保有完整的骨小梁结构，少有游离残端，骨小梁内还可见到胶原纤维和新生骨， 这与国内外研究结果是一致的[3，4，14]。 这表明卵巢切除手术可以促进骨质的丢失进而形成骨质疏松， 术后3个月腰椎即表现出明显的骨质量减低和骨小梁结构塌陷。

卵巢摘除手术可以促进骨质疏松的形成，是建立绝经后骨质疏松模型的可靠办法。 术后3个月是骨质疏松模型建立成功的关键时点，骨密度、骨转换指标和骨组织结构在卵巢切除术后3个月均出现明显的变化，表现出骨质疏松。 DXA 检测腰椎骨密度是早期筛查骨质疏松的安全可靠的方法，术后10 周即可出现明显的变化，腰椎BMD 下降20%可作为骨质疏松模型建立成功的一个评价指标。血清骨转换指标出现变化略晚，可作为骨质疏松诊断的次要参考指标。 绝经后卵巢功能的降低和激素水平紊乱可能是骨质疏松形成的重要原因， 但卵巢调节骨转化水平的具体机制及如何通过改善或者重建卵巢功能进而治疗骨质疏松，仍需进一步深入研究。