实脾消水乳膏对肝癌H22腹水瘤小鼠免疫调节作用的研究

王 贵 ，贾立群，邓 博，吴梦雨，娄彦妮，李 园★

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院 中西医结合肿瘤科，北京 100029）

图4 小鼠腹水超声图

恶性腹水是多种恶性肿瘤晚期常见的并发 症，可见于消化道肿瘤、卵巢癌、子宫癌、腹膜癌等，亦有20%的恶性腹水原发灶不明，约50%的恶性肿瘤病例以恶性腹水为表现或症状，预后差，生存期约1~6个月[1，2]。 恶性腹水引起的持续加剧的腹胀、疼痛、呼吸困难，严重影响患者的生活质量。 利尿剂、腹腔穿刺放液可暂时缓解症状，但不适宜频繁使用[3]。 前期动物实验研究[7，8]发现，实脾消水乳膏能够明显减少腹水量、 促进肿瘤细胞凋亡。 本研究旨在探究实脾消水乳膏对肝癌H22 恶性腹水小鼠的免疫调节功能的影响。

1 材料

1.1 药物、动物与细胞

实脾消水乳膏由黄芪、桂枝、大腹皮、莪术、牵牛子、红花、车前子、冰片8 味药组成，由中日友好医院中药制剂所提供，40g/瓶，每克乳膏相当于生药4.5g，临床拟用剂量：0.1g/cm2，8h/d。 氢氯噻嗪片购于天津力生制药股份有限公司 （国药准字H12020166，批号1804008）。

健康雄性昆明小鼠，SPF 级，24 只， 体重18~22g， 购于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK（京）2010-0001。饲养于中日友好医院临床医学研究所动物实验室（SPF 级），许可证号：SYXK（京）2016-0043。 癌细胞由H22 腹水型肝癌荷瘤小鼠腹水分离而来， 荷瘤小鼠购自中国协和细胞库。

1.2 仪器与试剂

天平，离心机：美国sigma 公司；Visual Sonics小动物超声仪：Fujililm。 全自动血细胞分析仪：日本光电工业株式会社； 流式细胞仪：BD FACS Canto； 抗小鼠CD4 FITC 单克隆抗体、 抗小鼠CD25 APC 抗体、抗小鼠Foxp3 PE 抗体、抗CD8单克隆抗体， 购自Tonbo 公司。 IL-2 （批号：190616）、IL-10 （批号：190421） 试剂盒购自美国eBioscience 公司。

2 方法

2.1 制备实脾消水乳膏

方中药物除冰片外， 药材加8 倍量的水回流提取2 次，每次2h，滤过，合并滤液，减压浓缩，用时将冰片以乙醇溶解后迅速加入，混匀，即得。

2.2 小鼠腹水瘤模型制备及分组给药

取稳定传代至d7 的肝癌H22 腹水瘤小鼠，无菌抽取腹水，生理盐水洗涤3 次，1500r/min，离心5min，弃上清，生理盐水调节腹水细胞悬液浓度为2×107个/ml，小鼠腹腔注射配制好的细胞悬液0.2ml/只（约含H22 细胞4×106个细胞），复制肝癌H22 腹水瘤荷瘤小鼠。

将24 只小鼠随机分为正常组（Ctrl）、模型对照组（Model）、氢氯噻嗪组（HCTZ）、实脾消水乳膏组（SPX），每组6 只。 除正常组外，其他组小鼠均于第0 天制作腹水瘤模型。 氢氯噻嗪组实验开始予小鼠氢氯噻嗪13mg/kg 灌胃给药； 实脾消水乳膏组实验开始给予实脾消水乳膏，剂量0.1g/cm2，涂抹于褪毛后的整个腹壁， 并用保鲜膜胶带固定8h。 每天给药1 次，连续给药14d。 正常组与模型对照组予等量的生理盐水与空白基质制成的成型乳膏涂抹于腹部。

2.3 小鼠体重及腹围的测量

研究开始至d14，隔日称量小鼠体重，测量小鼠腹围。将小鼠水平仰卧位固定放置，测量其髋关节上侧腹部最膨隆部位圆周长， 记录体重及腹围值，绘制小鼠平均体重、腹围变化曲线。

2.4 小鼠腹水量的测定

d14 褪去腹部毛后， 将小鼠水平仰卧位固定放置，使用小动物超声仪测量各组小鼠腹水深度，取其腹腔积液最深处直径。

2.5 小鼠脏器重量的测量

小鼠连续给药14d 后，处死小鼠，取心脏、胸腺、脾脏、肝脏、肾脏，称量其净重。

2.6 小鼠血液学参数的测定

d14 处死小鼠，取血，血细胞分析仪分析小鼠红细胞、血红蛋白、白细胞总数、血小板计数、中性粒细胞百分比、单核细胞百分比、淋巴细胞百分比变化。

2.7 小鼠CD4+、CD8+T 淋巴细胞、Treg 细胞的测定

取小鼠静脉全血，肝素抗凝后，加入红细胞裂解液和不同荧光标记抗体，室温避光孵育，磷酸盐缓冲液冲洗，流式细胞分析仪检测，记录CD4+和CD8+T 淋巴细胞、Treg 细胞比例。

2.8 小鼠血清IL-2、IL-10 的表达

取小鼠静脉血，分离血清，按ELISA 操作试剂盒说明，测定细胞因子IL-2、IL-10 的表达。

2.9 统计学方法

3 结果

图1 各组小鼠体重的变化

图2 各组小鼠腹围的变化

图3 各组小鼠腹腔积液最深直径

3.1 各组小鼠体重及腹围变化。

与正常组（Ctrl）比较，模型组（Model）小鼠体重增长迅速；与模型组比较，氢氯噻嗪组（HCTZ）体重增长缓慢，实脾消水乳膏组（SPX）小鼠体重增长趋势明显下调（P＜0.05）（见图1）。 与正常组比较，模型组小鼠腹围于d6 开始迅速增长，腹围明显增大（P＜0.01）。与模型组小鼠比较，实脾消水乳膏组与氢氯噻嗪组小鼠腹围增长趋势缓慢（P＜0.05）（见图2）。 小动物超声仪检测小鼠腹腔积液最深处直径，发现与模型组比较，实脾消水乳膏及氢氯噻嗪组小鼠腹水量降低（均P＜0.01），2组之间未见明显差异（图3，图4 见封二）。

3.2 各组小鼠各脏器重量的变化

表1 示各组小鼠心脏、胸腺、脾脏、肝脏、肾脏各脏器重量的比较，我们发现与正常组小鼠相比，肝癌H22 腹水瘤小鼠的心脏、脾脏、肝脏、肾脏重量未发生明显改变。胸腺重量减轻明显（P＜0.01），实脾消水乳膏组小鼠胸腺重量增加（P＜0.01）。

3.3 各组小鼠血液学参数

表2 示，与正常组相比，H22 肝癌腹水瘤小鼠出现红细胞降低 （P＜0.05）、 血红蛋白降低 （P＜0.01）、白细胞升高、血小板升高（P＜0.05）和淋巴细胞百分比降低（P＜0.05）。 实脾消水乳膏组能够提高血红蛋白，增加淋巴细胞百分比，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3.4 实脾消水乳膏对腹水瘤小鼠CD4+、CD8+ T淋巴细胞、Treg 细胞的影响

通过对血液中T 细胞亚群分析， 与正常小鼠相比，肝癌H22 腹水瘤小鼠CD4+T 淋巴细胞比例减少，CD8+T 细胞比例增加，Treg 细胞比例增加，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。 实脾消水乳膏能够增加CD4+T 淋巴细胞比例 （P＜0.05），对CD8+T 淋巴细胞及Treg 细胞有下调的趋势，但未见显著性差异（表3）。

3.5 实脾消水乳膏对腹水瘤小鼠血清IL-2、IL-10 表达的影响

表1 小鼠各器官脏器重量（±s，g）

表1 小鼠各器官脏器重量（±s，g）

注： 与正常组比较，* P＜0.05，** P＜0.01；与模型组比较，# P＜0.05，## P＜0.01。

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表2 各组小鼠血液学参数的变化（±s）

表2 各组小鼠血液学参数的变化（±s）

注： 与正常组比较，* P＜0.05，** P＜0.01；与模型组比较，# P＜0.05，## P＜0.01。

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表3 小鼠CD4+、CD8+ T 淋巴细胞、Treg 细胞的测定（n=6）（±s，%）

表3 小鼠CD4+、CD8+ T 淋巴细胞、Treg 细胞的测定（n=6）（±s，%）

注： 与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

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图5 示，模型组小鼠血清IL-2 表达较对照组小鼠降低 （P＜0.05），IL-10 含量显著高于对照组（P＜0.05）。 与模型组比较， 实脾消水乳膏组IL-2水平显著升高（P＜0.01），IL-10 表达量降低。

4 讨论

恶性腹水属于中医“鼓胀”“臌胀”范畴，病机属本虚标实、虚实夹杂之证，以肺、脾、肝、肾虚为本，湿浊、痰饮、淤血内停为标。故治则当为益气健脾、温阳利水、行气活血。 中医药在恶性腹水的治疗方面具有一定疗效[6]。实脾消水乳膏是我科专家依“内病外治”理论和“扶正祛邪”治则，据多年临证经验研制而成的治疗恶性胸腹水的外用乳膏剂。实脾消水乳膏方以黄芪健脾益气扶正为君药，桂枝化气行水、大腹皮行气宽中，莪术行气活血为臣药，牵牛子泻水消积，红花活血化瘀，车前子利水渗湿，冰片共为佐药。经过临床及多中心随机对照试验，验证其能够减少腹水量，改善腹胀、呼吸困难等症状，提高患者生活质量[7，8]。研究[9~12]显示，黄芪水煎提取物能够提高淋巴细胞、 单核细胞、CD4+/CD8+比例，升高IL-2 水平，降低CD8+细胞比例，发挥增强机体免疫功能，增强肿瘤患者T 淋巴细胞亚群、自然杀伤细胞（NK）和巨噬细胞的杀伤力，发挥抗肿瘤的作用。

恶性腹水的发生发展与机体免疫功能强弱关系密切， 本实验旨在从免疫调节角度探究实脾消水乳膏发挥作用的机制。研究发现，给小鼠腹腔注射肝癌细胞后， 小鼠体重于d7 开始迅速增长，腹围也于d7 开始增长迅速， 提示随着癌细胞的增殖，腹水开始大量生成。而实脾消水乳膏组小鼠体重及腹围增长缓慢， 显示出对恶性腹水的治疗作用。对各脏器净重称量发现，各组间心脏、脾脏、肝脏、肾脏净重未见明显差异，提示实脾消水乳膏无明显毒副作用。胸腺和脾脏是机体的免疫器官，其重量一定程度可反映机体免疫功能的强弱。 本实验观察到肝癌H22 腹水瘤小鼠胸腺萎缩，实脾消水乳膏给药组小鼠胸腺重量较模型组增加， 提示此方能增强免疫功能， 对免疫器官萎缩起到一定调节作用。 其对脾脏免疫器官的调节作用未观察到，有待扩大实验进一步研究。

图5 对各组小鼠血清IL-2、IL-10 表达的影响

观察各组小鼠的血象变化， 发现与正常组相比，肝癌H22 腹水瘤小鼠出现红细胞降低、血红蛋白降低、白细胞升高、血小板升高、淋巴细胞百分比降低。实脾消水乳膏组能够提高血红蛋白量，增加淋巴细胞百分比， 提示实脾消水乳膏有补气生血，增强免疫之功效。

T 细胞是获得性免疫功能的重要作用细胞。免疫细胞的检测可反映机体的细胞免疫功能。 成熟T 细胞主要分为CD4+和CD8+亚群。 CD4+细胞是辅助性T 细胞， 主要表现为诱导功能，CD8+细胞是细胞毒性T 细胞，发挥免疫抑制功能，抑制免疫应答。 生理情况下，机体的CD4+细胞和CD8+细胞按一定比例保持平衡，维持机体免疫功能正常。CD4+/CD8+值降低反映机体免疫功能降低，疾病预后差。 研究显示在肿瘤状态下，CD3+、CD4+细胞计数及CD4+/CD8+比值均显著低于健康人群， 提示肿瘤细胞抑制CD4+细胞诱导的细胞免疫及体液免疫[13]。 与以往研究一致，本研究亦在肝癌腹水瘤小鼠发现CD4+细胞减少、CD8+细胞增加等免疫功能被抑制的表现， 实脾消水乳膏能够增加CD4+T淋巴细胞数目，增强机体细胞免疫。

Treg 是一类具有免疫抑制功能的T 细胞亚群，在维持机体免疫平衡中发挥重要作用，其能够分泌细胞IL-10、TGF-β 等细胞因子维持免疫耐受，可导致肿瘤细胞免疫逃逸[14]。 研究发现肿瘤机体外周血及肿瘤微环境中Treg 比例增加，且与预后呈负相关[15，16]。 本研究亦发现H22 肝癌腹水小鼠血液中Treg 百分比增加，然而未发现实脾消水乳膏对其有明显的调节作用。

细胞因子是机体免疫细胞发挥免疫功能的主要介质，IL-2 是机体重要的免疫应答因子， 是最强有力的T 细胞生长因子。 IL-10 由Treg 等细胞产生，发挥免疫抑制功能。 本实验观察到H22 肝癌腹水瘤小鼠IL-2 表达降低，IL-10 水平增高，实脾消水乳膏能够升高IL-2 表达水平。

综上所述， 实脾消水乳膏能够减少肝癌H22腹水小鼠的腹水量，对肝癌H22 腹水瘤小鼠的免疫功能具有正向调节作用。