应用高通量测序技术对东部白松和旱柳叶片表面真菌多样性的测定1)

陈少鹏 崔亚静 侯婉晴 庄倩倩 刘颖 吕伟伟

(吉林农业科技学院，吉林省·吉林市，132101) (吉林市林业科学研究院)

园林植物是维护城市生态平衡的重要一环，其生态效益在空气污染日益严重的今天尤显重要。空气中的微生物是引起人呼吸道疾病的主要原因之一[1]，很多园林植物能通过释放挥发性有机物来抑制周围微生物的生长[2]。通常，植物叶片直接与空气相接触，面积巨大，因此植物叶片上常吸附着大量的微生物。有研究表明，土壤和叶片是所有地点近地表大气中重要的微生物来源[3]，但是对于植物叶面微生物的研究还相对较少[4-5]。一些学者对烟草(Nicotianatabacum)[6]、芒果(Mangiferaindica)[7]、红树(Lumnitzeralittorea)[8]等叶面微生物的种类、多样性等方面进行了研究，结果表明不同植物叶片表面有着不同的微生物种群，且对表面吸附的菌种具有一定的选择性。现有的研究手段和重点多集中于植物浸提液对真菌、细菌的抑制作用[9-10]，或者是植物对周围空气中微生物的影响[11-12]。但是人工提取植物浸出液的方法具有很大的局限性，而因空气的流通性则很难确定是否是植物影响空气中的微生物分布，因此这些方法并不能直接说明植物在自然状态下的除菌能力。所以，直接对植物叶片表面吸附的微生物进行比对研究最能够说明植物叶片对微生物群落的影响。目前，植物叶片或者根系菌群的分离和鉴定主要采用琼脂平板扩散、滤纸贴片等方法[13-14]，而这些方法均有费时、低效和不准确等缺点，同时菌的分离和鉴定也较为困难。近些年，随着分子生物学技术的发展，利用序列分析、荧光定量PCR(RT-PCR)等技术对微生物的种群进行分析鉴定越来越受到重视。一些研究者利用RT-PCR、DNA指纹图谱和16S rDNA克隆文库的方法来检测空气中细菌的基因结构和微生物多样性[15-17]。本研究以从加拿大引种的东部白松(Pinusstrobus)和园林绿化中常用的旱柳(Salixmatsudana)叶片为材料，基于Illumina HiSeq测序平台，利用双末端测序的方法，构建小片段文库进行测序。通过对Reads拼接过滤、分类操作单元(OTUs)聚类，以真菌的18S rDNA序列和ITS(内转录间区)序列进行物种注释，进一步进行丰富度、多样性等分析，以期揭示2种树种叶片表面真菌的物种构成，并为城市园林的生态建设提供理论支持。

1 材料与方法

样品采集：以吉林农业科技学院园林树木资源圃中生长健壮、无病虫害且位置相邻的5年生的东部白松和旱柳植株为试验材料，于2018年8月，选择连续7 d无降水的时间段进行取样，采样时间为2018年8月2日上午10：00，取样点选择树木外部临近街道的中下部叶片，其中旱柳树高4.5 m，株距5.0 m；东部白松树高3.0 m，株距4.0 m。每种树木取样5 g，取样后立即放入经高压灭菌的无菌自封袋中，做好标记后放入保温箱中(0 ℃)带回实验室。每种树木叶片以相同方式取样3次，记做3次重复。

DNA提取：将样品带回实验室后，用200 mL无菌水将东部白松和旱柳叶片分别浸泡于无菌瓶中30 min，之后采用超声波清洗机(预先用体积分数75%酒精擦拭)超声(室温24 ℃，超声频率25 kHz)15 min，将全部液体转移至4个50 mL离心管中，室温在12 000 r·min-1离心5 min，将4管中的沉淀转移合并至1.5 mL离心管中。采用真菌总DNA提取试剂盒(OMEGA,USA)进行真菌DNA的提取。真菌总DNA经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，用超微量紫外光分光光度计(NanoPhotometerTMP-Class,USA)测定OD值，A260/A280在1.70～1.90，DNA质量浓度为100 μg·L-1以上，满足后续试验要求，于冰箱中-80 ℃保存。

建库测序：提取东部白松和旱柳表面真菌总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，然后经过PCR扩增，将单一条带切胶回收后，进行文库质检，之后采用Illumina HiSeq 2500进行测序。

OTU分析及物种注释：使用QIIME[18](1.8.0版)软件中的UCLUST[19]对测序获得的序列在97%的相似度水平下进行聚类并获得OTU，再与真菌分类学数据库(UNITE，http://unite.ut.ee/index.php)进行比对，最终在门、纲、目、科、属、种层面上进行分类学注释。

数据分析：物种注释、Alpha多样性、Simpson指数、Shannon指数等分析采用KRONA、Mothur(v.1.30版，http://www.mothur.org/)等软件进行分析，绘图采用Excel、R语言。

2 结果与分析

2.1 测序数据质量

通过统计各阶段东部白松叶片真菌(编号：M01)和旱柳叶片真菌(编号：M02)DNA测序的序列数目，用以评估测序数据质量(表1)。从表1可见，M01和M02经Illumina HiSeq 2500测序后获得的双端测序序列分别有731 681、1 045 005条，通过双端拼接、过滤优化后获得有效数据分别为604 110、865 093条，占全部所测序列的82.56%和82.78%。M01平均序列长度为230 bp，Q30质量为97.68，大于80%；M02平均序列长度为236 bp，Q30质量为97.62，大于80%，说明测序质量合格，可以进行后续分析。

表1 东部白松和旱柳叶片真菌测序数据处理结果

注：Q30为碱基识别精度大于99.9%的碱基数目占总碱基数目的比例。

2.2 物种注释及分类

2.2.1 物种分类统计

M01包含已经注释的真菌分为3门、16纲、36目、65科、72属总计75种。而M02包含已经注释的真菌分为3门、16纲、33目、60科、78属总计75种。在目和属分类级别上M02优于M01，在科级别上则弱于M01。在已经标注的M01和M02样品中，在种分类水平下共同种为65种，占比86.67%；差异种为10种，占比13.33%。

2.2.2 物种相对丰富度

为了使结果表现更为清晰，仅显示丰度水平前10的物种，并将其他物种合并为其他，未分类和未分配用以代表在该分类级别上未得到分类学注释的物种。根据Zhu et al.的分类方法，将相对丰度高于10.00%定义为优势菌群，而相对丰度低于0.01%定义为稀有菌群[20]。由表2可见，在门分类级别上M01和M02的优势菌群主要为子囊菌门(Ascomycota)，相对丰富度达85.12%，其次为担子菌亚门(Basidiomycota)；在纲分类水平上M01和M02优势菌群主要为座囊菌纲(Dothideomycetes)，相对丰富度达72.00%以上，而M02外担菌纲(Exobasidiomycetes)的相对丰富度高于M01，M01酵母纲(Saccharomycetes)的相对丰富度则远高于M02；在目分类级别上M01和M02的优势菌群主要为格孢腔菌目(Pleosporales)、煤炱目(Capnodiales)和座囊菌目(Dothideales)，其中M01的裂殖酵母目(Saccharomycetales)相对丰富度为9.69%，远高于M02，二者相差27598倍；在科分类水平上枝孢霉科(Cladosporiaceae)、外担菌科(Aureobasidiaceae)、小双腔菌科(Didymellaceae)为M01和M02的优势菌群，而假球壳科(Pleosporaceae)为M02优势菌群，裂殖酵母科(Schizosaccharomycetaceae)则仅在M01中发现；在属分类水平上枝孢菌属(Cladosporium)、出芽短梗霉属(Aureobasidium)、链格孢属(Alternaria)为M01和M02的优势菌群，念珠菌属(Candida)仅存在于M01；在种分类水平上皱枝孢(Cladosporiumdelicatulum)、出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)为M01和M02的优势菌群，热带假丝酵母(Candidatropicalis)仅存在于M01，M01中异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)和克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)的相对丰富度远高于M02。

表2 东部白松和旱柳叶片真菌自然分类系统的相对丰富度

续(表2)

2.3 多样性

在97%相似度水平下，各样品Alpha多样性指数见表3。Alpha多样性中的Chao1和ACE指数可衡量物种丰度即物种数量的多少。Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性[21]。从表3可见，M02的OTU数量高于M01，Chao1和ACE也高于M01。Simpson指数M01高于M02，Shannon指数M02高于M01。M01和M02的文库覆盖率均为1，说明M01和M02的物种均被测出。由图1A可知，M01、M02分别在Shannon指数为2.56和2.71时曲线趋于平坦，说明OTU种类不会随测序量增加而增长。M02大于M01，说明M02的物种比M01更加丰富。由图1B可知，M02在物种的组成丰富度上优于M01(横轴)，而M01的曲线与M02相比较更加的平滑，说明M01物种组成的均匀度更好。

表3 东部白松和旱柳叶片真菌多样性指数

图1 东部白松和旱柳叶片真菌Shannon指数和相对丰富度曲线

3 结论与讨论

对东部白松和旱柳叶片表面真菌群落多样性的研究结果表明，东部白松叶片表面包含的真菌分为3门、16纲、36目、65科、72属总计75种；旱柳真菌分为3门、16纲、33目、60科、78属总计75种。东部白松叶片表面真菌的Simpson指数大于旱柳，而旱柳叶片表面真菌的Shannon指数大于东部白松，旱柳的叶片表面真菌物种丰富度更高，但是东部白松叶片表面真菌的均匀度更高。

目前，叶表面微生物多样性及生态学的研究主要集中在具有特定目标的微生物上，Beattie et al.对豆叶片上假单胞菌(Pseudomonassyningae)在不同环境条件下的存活、生长和定位进行了研究[22]，而Jackson et al.则针对南方木兰(Magnoliagrandiflora)叶绿体细菌进行了研究[23]。国外学者对叶面上的附生种群研究较多，Ercolani对不同树龄和不同月份的橄榄(Canariumalbum)叶片上的细菌进行了分离鉴定，认为同龄叶片上的细菌菌群结构非常相似，但是不同龄的叶片菌群则差异较大[24]；在对苦苣(Cichoriumendivia)叶片表面的细菌种群进行研究时发现，微环境和环境条件之间的相互作用以及叶片的生理条件对附生细菌种群大小有着显著的影响[25]。本研究结果表明，东部白松和旱柳叶片表面真菌种群数目均为75种，二者在门、纲、目、科、属、种分类水平上的优势菌群较为类似，均有相同的优势种群，如枝孢菌属和链格孢属。一些研究也表明，枝孢菌属和链格孢属是很多高等植物叶片表面的优势菌群[26-27]，这得益于它们良好的传播性[28]。但是东部白松和旱柳在一些真菌种群上则体现出了一定的选择性。酵母纲、裂殖酵母目、裂殖酵母科仅在东部白松上为优势种群，而在旱柳上则为劣势种群，二者丰富度相差20 000多倍，这说明东部白松对酵母类的真菌具有更好的选择性。Collins et al.在挪威云杉(Piceaabies)叶片上能够观察到大量酵母菌，而且在整个挪威云杉生长季中酵母菌的数量变化较小[29]，与本研究结果类似，这有可能说明酵母菌类更容易吸附在针叶树种叶片表面，如：热带假丝酵母、异常威克汉姆酵母和克鲁维毕赤酵母。旱柳与东部白松叶片真菌种类相比较，旱柳在各个分类水平上的相对丰富度并不突出，但是在物种多样性上优于东部白松。在物种多样性分析中，Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，说明样品的物种多样性越高[21]。旱柳的Shannon指数值高于东部白松，Simpson指数值低于东部白松，这说明旱柳叶片表面的真菌种群多样性高于东部白松，物种丰富度曲线也表现出相同的结果。这种针叶树种和阔叶树种叶片表面真菌群落多样性的差距可能是由于二者叶片表面结构的不同所导致的，但是没有相关文献直接指出不同叶片表面结构对微生物种群有影响。此外，针对热带大西洋植物树冠叶片表面微生物多样性的研究发现，不同的微生物群落会选择不同的植物[30]；Yang et al.发现微生物群落结构在相同植物物种的不同个体上相似，但在不同植物物种上是独特的[31]，这些研究结果与本研究结果类似。