铁死亡信号介导抗肿瘤作用的细胞器调控机制研究进展

郭倪君，林忠宁，林育纯*

(分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室，厦门大学公共卫生学院，福建 厦门 361102)

铁死亡作为新近发现的一种调节性细胞死亡(regulated cell death，RCD)方式，其信号通路参与致癌和抗肿瘤作用的调控[1]。研究表明，铁死亡信号分子的蛋白质翻译后修饰(posttranscription modifications，PTMs)参与铁死亡调控；外源化学物作用下，不仅细胞内各个细胞器和多细胞器之间串话可介导铁死亡信号，触发铁死亡信号的某一细胞也可通过细胞间通讯介导损伤相关分子模式或外泌体等将铁死亡信号传递从而形成传播性细胞死亡[2]。本文以铁死亡信号通路为线索，综述多细胞器参与铁死亡的执行机制，列举诱导铁死亡的药物、植物化学物和纳米粒子等介导的抗肿瘤作用，旨在为致癌作用和肿瘤化学预防提供科学依据。

1 抗癌作用相关的铁死亡信号分子及其调控

1.1 铁死亡的生物学特征

铁死亡是一种可被天然刺激或外源合成诱导剂作用下发生的铁依赖性脂质过氧化(lipid peroxidation，LPO)介导的RCD；最初于2003年在小分子Erastin选择性杀死致癌RAS基因突变的人成纤维瘤BJ 细胞中被观察到；2012 年Stockwell 等正式使用“ferroptosis”来描述这种可诱导的非凋亡性RCD 形式[1]，此后与铁死亡相关的信号通路及其调节机制日益被证实。

铁死亡细胞形态学上主要表现为线粒体变小、嵴减少或消失、膜皱缩和外膜破裂。Dixon等归纳了铁死亡细胞的3个基本特征，即还原性铁的激活、含多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的磷脂的过氧化、脂质过氧化物修复功能损失[1]。外源因素诱导的铁死亡通路涉及蛋白质(如谷胱甘肽过氧化物酶4，glutathione peroxidase 4，GPX4)、脂质(如PUFA)和氨基酸(如半胱氨酸)等调节因子构成的信号网络的调控。这些特征完全不同于其他RCD，具体独特的生物学特性见表1。铁死亡与自噬存在关联，当细胞响应于铁死亡诱导剂后，自噬小体积聚、细胞内铁贮存蛋白的铁蛋白降解、铁水平上调，促进细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的积累而引发铁死亡；自噬激活可有利于细胞铁死亡，敲低自噬相关基因可抑制铁死亡；自噬抑制剂氯喹(chloroquine，CQ)也可防止依赖于铁死亡的组织损伤[3]。此外，分子伴侣介导的自噬(chaperonemediated autophagy，CMA)参与铁死亡过程，Erastin 诱导CMA分子标志的溶酶体相关膜蛋白2A 水平增加可促进GPX4 降解，而抑制CMA可稳定GPX4并减少铁死亡[4]。

1.2 诱导铁死亡的执行信号通路

诱导性铁死亡的执行信号主要经由两条典型途径(图1)。一是游离铁或含铁脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)负责氧化膜PUFA、进而导致脂质ROS 的形成。铁可经由转铁蛋白(transferrin，TRF)进入细胞；通过限制铁摄取，可使转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR)介导的转铁蛋白-铁复合物下调，抑制铁死亡[10]。二是清除磷脂氢过氧化物的GPX4 的失活或抑制。胞外胱氨酸耗竭或胱氨酸/谷氨酸逆向转运子(cystine/glutamate antiporter system，System Xc-)、转硫途径及谷胱甘肽(glutathione，GSH)合成被抑制可间接抑制GPX4；Ras选择性致死复合物3(Ras selective lethal compound 3，RSL3)等类似结构化合物可通过共价修饰直接抑制GPX4 功能，以不改变细胞内GSH水平的方式诱导铁死亡[11]。

1.3 铁死亡作为新的肿瘤标志信号

铁死亡通路调节因子与多种已知的肿瘤标志存在关联性。Chen等发现RSL3可抑制神经胶质瘤U87细胞中活化转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)过表达，诱导肿瘤标志之一的血管生成增强；而溶质载体家族7 成员11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)是ATF4的驱动因素，提示铁死亡耐受与肿瘤的血管生成信号有关[12]。Heike等发现肾透明细胞癌表现为极强的代谢重编程能力，抑制β-氧化或线粒体ATP合成在肿瘤抑制基因VHL重建细胞中可恢复铁死亡敏感性，提示肿瘤标志之一的能量代谢信号与铁死亡的微妙关系[13]。Wang等发现程序性死亡配体1抗体联合降解胱氨酸和半胱氨酸的工程酶，可协同增强小鼠卵巢癌ID8细胞荷瘤小鼠中铁死亡特异性LPO，机制是激活CD8+T 细胞释放干扰素γ，直接抑制System Xc-表达；提示胱氨酸限制是诱导肿瘤微环境中肿瘤细胞铁死亡的潜在内源触发因素，肿瘤细胞铁死亡是CD8+T细胞介导肿瘤清除的另一机制，靶向肿瘤中铁死亡相关代谢信号通路可改善癌症免疫疗法的功效[14]。Wu 等发现E-钙黏蛋白高表达、激活的肿瘤抑制因子神经纤维瘤膜蛋白2 及促增殖Hippo 信号传导途径可抑制铁死亡，并经由铁死亡参与肿瘤细胞间通讯；该信号轴中任一因子的恶性突变可以预测人结肠癌细胞对诱导铁死亡介导抗肿瘤的反应性[15]。因此，铁死亡通路信号分子的筛查可为外源因素诱导致癌作用和肿瘤预防控制提供潜在生物标志。

表1 不同RCD的主要细胞生物学特征比较

图1 外源化学物经由多细胞器参与铁死亡信号网络调控的抗肿瘤机制示意图

1.4 铁死亡信号分子的PTMs调控

参与铁死亡调节的诸多信号分子受PTMs的调控。Sun等在Erastin 处理人宫颈癌Hela 细胞中观察到蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)介导热休克蛋白β1(heat shock protein β1，HSPB1)磷酸化，进而减少细胞铁摄取及脂质ROS促进铁死亡抗性；在小鼠荷瘤模型中发现抑制HSPB1磷酸化可增加Erastin的抗癌活性[16]。Song等揭示Erastin诱导AMP活化蛋白激酶(AMPactivated protein kinase，AMPK)介导HCT116 细胞中自噬调节因子Beclin 1 磷酸化，通过与SLC7A11 结合，抑制System Xc-通路介导铁死亡[17]。Chen等验证在铁死亡期间电压依赖性阴离子选择性通道蛋白2(voltage-dependent anion selective channel protein 2，VDAC2)的内源性羰基化，VDAC2C210A突变的人纤维肉瘤HT1080 细胞能免于RSL3 诱导的铁死亡，提示半胱氨酸210(Cys210)位点的修饰与促细胞铁死亡有关[18]。Kerins 等通过药物敏感性基因特征的研究，发现铁死亡诱导剂对富马酸(fumarate，FH)缺失的人肾癌UOK262细胞具有选择性毒性，是由于GPX4Cys93易发生富马酸修饰，提示靶向FH 失活细胞可作为诱导铁死亡的抑癌策略[19]。Wang等采用乙酰转移酶处理非小细胞肺癌H1299细胞，发现p53中赖氨酸98(K98)位点乙酰化可诱导铁死亡、且不受已知位点(K117/161/162)乙酰化状态的影响[20]。因此，铁死亡信号通路调节分子的PTMs调控是外源因素诱导铁死亡发生发展的潜在分子机制。

2 不同细胞器参与铁死亡调节的信号网络调控机制

2.1 线粒体参与铁死亡调节

线粒体作为细胞死亡及存活信号整合的关键细胞器平台，促成多种RCD 的发生[21]。Krainz 等合成靶向线粒体ROS 的清除剂XJB-5-131，发现其比广泛ROS 清除剂能更有效抑制HT1080 等细胞铁死亡的发生[22]。Yuan 等发现Erastin 以铁依赖性方式促进人肝癌HepG2和Hep3B细胞线粒体外膜上含铁蛋白CDGSH 铁硫结构域蛋白1(CDGSH iron sulfur domain 1，CISD1)表达；抑制CISD1 表达可增加铁介导的线粒体内LPO 和有助于诱导铁死亡；吡格列酮稳定CISD1的铁硫簇可抑制铁死亡；表明CISD1 在保护细胞免受铁死亡中的新作用[23]。Gao 等通过Erastin 直接抑制System Xc-及限制HT1080 细胞的半胱氨酸摄入和合成，确证了线粒体只是对于半胱氨酸缺乏诱导的铁死亡是必不可少；而单纯通过RLS3直接抑制GPX4诱导细胞铁死亡，却不是线粒体依赖性的[24]。因此，线粒体在铁死亡中的作用可能与细胞类型(如不同肿瘤细胞等)、不同受试物(如抗癌药物等)诱导的RCD(包括铁死亡)的调节信号网络有关。

2.2 内质网参与铁死亡调节

内质网(endoplasmic reticulum，ER)稳态的失调可激活ER应激，诱发未折叠蛋白反应。与铁死亡相关的ER 应激信号是由ATF4介导C/EBP同源蛋白通路激活，且该通路介导p53非依赖性的p53上调凋亡调节因子参与了铁死亡与凋亡之间的相互串话[25]。Dixon 等通过Erastin 和索拉非尼(sorafenib，Sora)诱导HT1080细胞铁死亡模型RNA测序显示ER应激信号通路分子激活，证明了ER应激与触发铁死亡的关联；提示靶向ER信号通路的调控在诱导铁死亡相关肿瘤化学预防中的作用[26]。Kagan等使用RSL3 处理小鼠胚胎成纤维Pfa1 细胞，发现脂质ROS 主要积累在线粒体基质外和ER上[27]；基于ER与线粒体之间密切接触和功能偶联的膜结构，即线粒体相关性内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM)的研究，提示MAM 介导的多细胞器间通信网络的调控在铁死亡参与致癌发生和抗肿瘤中的作用值得探究。

2.3 溶酶体参与铁死亡调节

溶酶体可降解蛋白质、脂质和损伤的细胞器，参与不同RCD 的生物信号传递功能[28]。Mancias 等揭示CQ 诱导乳腺癌MCF-7 细胞中核受体共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4，NCOA4)可与铁蛋白N端结合将其运输至溶酶体，介导铁蛋白自噬(ferritinophagy)过程，表明NCOA4 对铁稳态与铁死亡的重要性[29]。Torii 等发现脂质过氧化物与溶酶体共定位，且溶酶体抑制剂(如CQ 等)可减弱TRF 的细胞内转运或铁蛋白自噬降解、部分阻止细胞内铁的供应来抑制铁死亡[30]。Yang 等揭示CQ和早期自噬抑制剂spautin-1均能抑制RSL3诱导人非小细胞肺癌Calu-1细胞铁死亡，是由于核心生物钟蛋白——芳香烃受体核转运蛋白被泛素结合蛋白p62介导转运至溶酶体降解(该过程称为“clockophagy”)，促使缺氧诱导因子1α去稳定化而发生铁死亡；阻断clockophagy 及其后续信号可抑制铁死亡[31]。这些研究表明，溶酶体经由介导铁代谢和部分LPO参与肿瘤细胞中的铁死亡信号调节；因此，基于溶酶体能直接参与其他细胞器降解的功能[28]，其与细胞器之间的通讯介导的铁死亡有待进一步探明。

2.4 细胞核参与铁死亡调节

细胞核是致癌作用预防、抗肿瘤药物治疗和基因干预的理想靶标。与细胞凋亡时核DNA断裂和染色质固缩相比，铁死亡细胞核形态无明显改变[32]。细胞核中主要的两个铁死亡信号分子为p53 和核因子红细胞2 相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)。Jiang 等发现Erastin 诱导入核的胞核p53 在转录水平下调SLC7A11 表达，促进MCF-7 细胞及骨肉瘤U2OS细胞的LPO及铁死亡[33]。Xie等发现Erastin 处理HCT-116细胞中，胞膜上蛋白二肽基肽酶-4(dipeptidyl-peptidase-4，DPP4)与NADPH 氧化酶1(NADPH oxidase 1，NOX1)解离入核，与核p53 结合、抑制SLC7A11 的转录，诱导铁死亡耐受，提示信号分子竞争性结合核p53 可抑制铁死亡[34]。Mao 等发现Erastin 处理肺癌A549 细胞后GTPase 活化蛋白结合蛋白1(GTPase-activating protein-binding protein 1，G3BP1)的互作结构域可与p53 相关胞质lncRNA(P53RRA)结合互作，使胞质p53游离并入核致细胞周期停滞、凋亡和铁死亡[35]。Sun等发现Sora作用的HepG2 细胞中，Nrf2 易位至细胞核，上调金属硫蛋白-1G 基因的转录，增强该基因敲低的荷瘤裸鼠中Sora 的抗癌活性，提示Nrf2介导的铁死亡敏感性[36]。因此，参与铁死亡调控的核信号分子可以成为潜在的抗癌作用靶标。

3 外源化学物经由铁死亡信号网络调控抗肿瘤作用

3.1 合成药物在铁死亡诱导性肿瘤化学预防中的作用

Stockwell 等根据铁死亡发生途径归纳了4 类铁死亡诱导性合成药物，已有2类在肿瘤研究性实验中得到运用。Ⅰ类诱导剂Erastin及其同源物咪唑酮Erastin、哌嗪Erastin、以及抗炎药物柳氮磺胺吡啶和肝癌化疗药物Sora 等，通过抑制System Xc-的功能、限制胱氨酸输入而导致下游GSH耗尽及GPX4活性丧失[1]。Zhang等采用Ⅰ类诱导剂作用于野生型、稳定高表达肿瘤抑制因子BRCA1 相关蛋白1(BRCA1-associated protein 1，BAP1)和BAP1 突变型的人肾癌UMRC6 细胞，观察到仅稳定高表达BAP1的细胞中降低了SLC7A11启动子上的组蛋白2A去泛素化作用的利用率，以去泛素化依赖性方式抑制SLC7A11表达促进铁死亡[37]。Ⅱ类诱导剂RSL3、ML162 等小分子可与GPX4酶结构中的亲核活性位点硒代半胱氨酸共价相互作用，直接抑制GPX4 酶活性和致细胞脂质氧化还原修复功能丧失而诱导铁死亡；但由于其低溶解度和难以表征药代动力学，Ⅱ类铁死亡诱导性化学物暂不适合于人体临床试验[9]。

3.2 植物化学物在铁死亡关联性肿瘤化学预防中的作用

植物化学物具有良好的选择性和较低的毒性副作用的特点，已发现部分可诱导肿瘤细胞铁死亡。Lin 等发现青蒿素(artemisinin，ART)及其衍生物青蒿琥酯(dihydroartemisinin，DHA)可介导头颈部癌HEP-2 细胞中不稳定铁池(liable iron pool，LIP)增加，破坏铁依赖性细胞稳态诱导铁死亡[38]。Du 等发现DHA可诱导急性髓性白血病HL60和KG1细胞自噬、加速铁蛋白降解、增加LIP 促进铁死亡；铁硫簇装配酶的过表达及铁蛋白重链蛋白的重新表达均可抑制铁死亡，提示DHA经由铁代谢参与铁死亡[39]。此外，天然生物碱中的荜拨亭能显著增加PANC-1 细胞LPO 水平，经由铁死亡对肿瘤细胞产生毒性[40]；Wei等合成天然产物中三萜皂苷类似化合物D13作用于HCT116细胞，经由p53线粒体依赖性途径诱导铁死亡和凋亡的同步发生，增加抗肿瘤敏感性[41]。因此，天然植物化学物及衍生物经由铁死亡信号的肿瘤细胞毒性作用有望成为早期肿瘤化学预防的新方向。

3.3 纳米粒子在铁死亡诱导性肿瘤化学预防中的作用

由于纳米粒子的高负载、较强渗透性及保留效应、特异性靶向、可控释放和成像等特点，多种铁基纳米粒子的改造和修饰，已成为增强诱导肿瘤细胞铁死亡的铁死亡疗法的载药载体[42]。Zheng 等将聚乙烯亚胺/p53 质粒复合物与Fe3+、Fe2+及多酚物质单宁酸(tannic acid，TA)共价结合形成金属有机网络-p53(metal-organic network-p53，MON-p53)纳米颗粒，既抑制SLC7A11 又介导芬顿反应增加ROS，双重主导促进HT1080 细胞铁死亡[43]。Liu等合成Sora@Fe III TA纳米颗粒，在小鼠乳腺癌4T1细胞的溶酶体酸环境中电晕解离，释放Sora以抑制GPX4促进铁死亡[44]。Wang 等发现富含精氨酸的硅酸锰纳米泡(arginine-rich manganese silicate nanobubbles，AMSNs)可增强GSH 消耗效率，抑制GPX4 以促进人肝癌Huh-7 细胞铁死亡；期间AMSNs 的降解也有助于T1 加权的磁共振成像增强及用于协同治疗药物按需释放[45]。Shen 等将Fe3O4/Gd2O3杂化纳米颗粒、乳铁蛋白(lactoferrin，LF)和顺铂(cisplatin，cDDP)合成FeGd-HN@Pt@LF/RGD2-cDDP 缀合物，通过内吞作用内化到U87 细胞中，经内体摄取和降解时释放铁离子和cDDP 加速芬顿反应产生ROS 诱导癌细胞铁死亡[42]。Zhang 等利用Fe3O4磁性纳米团簇(nanocluster，NC)为核心，加载白细胞膜、转化生长因 子β 抑 制 剂(TGF-β inhibitor，Ti)、程 序 性 死 亡 蛋 白-1(programmed cell death protein 1，PD-1)抗体(Pa)合成Pa-M/Ti-NCs，尾静脉注射给予4T1 细胞荷瘤裸鼠，Pa 和Ti 在荷瘤组织中互作产生免疫原性微环境，加强极化M1 型巨噬细胞芬顿反应诱导原位瘤细胞铁死亡[46]。因此，将铁死亡调控机制与纳米颗粒的特性结合，可增加新型纳米医药在肿瘤防治中的优势。

4 总结与展望

环境因素暴露介导细胞应激和损伤的动态调控过程，涉及不同细胞器参与的RCD信号网络调节机制，是致癌作用筛查和干预以及肿瘤化学预防研究的焦点，为充分利用铁死亡，将其开发为抑制肿瘤进展的新应用提供依据。因此，仍需进一步探讨致癌和抗肿瘤过程中铁死亡的新调节通路。首先，机制方面，铁死亡中LPO下游的分子标志、铁死亡具体分子执行者等尚不清楚；其次，铁死亡与其他RCD并行调控细胞结局、多细胞器间膜接触和信号串话、信号网络分子间的互作及其PTMs修饰等的功能学调控值得深入研究；第三，应用方面，铁死亡抑制剂在外源物诱导致癌过程中的干预、铁死亡诱导剂在实验研究和临床(前)期试验中杀死癌细胞的具体效果未有确切结论。因此，本文有助于为今后开发靶向铁死亡信号网络中相关分子及细胞器调控的合成药物、植物化学物及纳米粒子等提供科学依据。