基于SNP芯片研究PI3K/Akt/mTOR通路上自噬相关基因SNPs与胃癌的关联

舒智雄，吴传城，吴晓丽，刘宝英*

(福建医科大学公共卫生学院，福建 福州350122)

胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，居消化系统肿瘤的首位[1]，是我国农村地区上消化道肿瘤死亡首要原因[2]，福建省仙游县更是我国恶性肿瘤尤其是胃癌的高发区[3]。大量研究表明自噬功能紊乱会导致肿瘤发生、影响肿瘤进展及预后[4]，近年来细胞自噬与胃癌的关系引起广泛关注[5]。自噬的激活涉及众多信号通路，其中磷脂酰肌醇3-激酶、丝苏氨酸激酶和雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase/mechanistic target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)等信号通路在自噬体的形成和成熟过程中发挥着关键性的作用[6]，抑制其信号传导可使自噬水平提高进而抑制肿瘤细胞的增殖[7]。PI3K/Akt/mTOR 通路上基因单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms，SNPs)的存在可能导致其信号传递受阻，从而参与肿瘤的发生发展[8]，但目前尚未见系统性分析该通路上与自噬相关的基因单核苷酸多态性与胃癌的关联性的研究报道。因此，本研究采用SNP芯片联合生物信息学筛检仙游县胃癌患者血液中与对照人群间差异的PI3K/Akt/mTOR 通路上相关基因SNPs，采用病例-对照研究分析筛选出来的SNPs与胃癌易感性的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

采用1∶1 配对的病例-对照研究，胃癌病例来源于福建省仙游县医院的胃癌新发病例。大样本纳入标准为：经手术或内窥镜取得组织标本，经病理确诊的新发病例；确诊日期为2013 年4 月—2017 年3 月；在仙游本地居住10年以上。芯片组纳入标准是在此基础上选择男性，年龄50～70 岁，经病理确诊为胃腺癌的患者。排除标准：经病理确诊为胃部炎症、良性病变及病情危重或不能清晰回答问题者及肿瘤继发病例和复发病例。

健康对照纳入标准：按性别、年龄、地区与病例进行配对，其中芯片健康对照选择年龄±3岁与病例进行配对，大样本健康对照选择年龄±5岁与病例进行配对。选在仙游本地居住10年以上。排除标准为：胃癌或慢性萎缩性胃炎的直系家属。

以上标本均要求资料和血样完整，最后SNP芯片检测阶段我们纳入病例和对照各96例，均为男性，年龄分布在52～71 岁。其中病例组平均年龄(63.8±4.6)岁，对照组平均年龄(63.8±4.7)岁。

在验证阶段纳入确诊胃癌病例622 例，正常对照622 例，其中男性466 对，女性156 对。病例组由312例贲门癌患者和310 例非贲门癌患者组成。病例组年龄分布在39～89 岁，平均年龄为(67.3±9.7)岁；对照组年龄分布在41～87 岁，平均年龄为(67.2±9.7)岁。经均衡性检验，病例组与对照组在年龄、性别、职业等方面差异均无统计学意义(P＞0.05)。文化程度和婚姻状况差异有统计学意义(P＜0.05)。病例组中高中及以上的文化程度比例低于对照组，已婚的婚姻状况比例高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

1.2 资料收集

采用统一设计的调查表，进行面对面的访谈式调查，内容包括研究对象的年龄、性别、文化程度、婚姻状况、职业史等相关因素，病例的病史资料经患者本人及医院同意后通过摘录电子病例获得。同时采集病例及对照人群的空腹外周静脉血5 mL，抽取的血样置于EDTA抗凝管，3 000 r/min离心10 min后，分装成血浆、白细胞、红细胞，置-80 ℃低温冰箱保存。本研究涉及的调查数据及人体数据，均已通过福建医科大学生物医学研究伦理委员会的审查，符合医学伦理相关规定和要求。

1.3 基因分型原理与位点的筛选

1.3.1 芯片基因分型原理利用Affymetrix 生产的920K Axiom Precision Medicine Research Array 对病例和对照的外周血白细胞中的总DNA进行单核苷酸多态性基因型检测。基因芯片分型技术采用酶介导及单碱基测序的全自动化流程，共包含可检测的位点92万余个，其中80 多万个SNPs 及临床相关变异位点经过GWAS 研究分析，对主要的祖先群体具有最佳的基因组覆盖率。

1.3.2 PI3K/Akt/mTOR通路上相关基因SNPs的筛选方法通过KEGG pathway 网站和Gene Ontology 数据库 汇 总 PI3K/Akt/mTOR、 Autophagy 通 路(Homo sapiens) 上所有基因， 利用Ensemble 数据库和HaploView 软件查找二者交集基因SNPs，并与芯片中的取交集，得到芯片中PI3K/Akt/mTOR 通路上与自噬有关基因SNPs，利用SPSS和Excel 软件通过卡方检验筛选出以上SNPs 在病例组和对照组中表达有差异(P＜0.05)的位点。同时将以上具有统计学意义SNPs所在的基因通过STRING、Cytoscape 软件做蛋白互作网络(protein protein interaction network，PPI network)分析基因编码蛋白间的相互作用，筛选关键节点基因。根据1000 Genomes Browser (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)查找以上关键节点基因SNPs 在中国南方汉族人群中的最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)，选择MAF 在0.15～0.4的位点，筛选功能预测有相应功能的SNPs，对各多态性位点进行Hardy-Weinberg 遗传平衡度(H-W 平衡)检验，选取基因型频率分布在健康对照人群中符合H-W平衡(P＞0.05)的位点作为候选基因位点进行后续实验分析。过程如图1。

1.3.3 大样本人群中基因分型原理与方法在622对病例对照人群样本中将5个候选SNPs区域的DNA模板通过PCR技术扩增，再使用特异的延伸引物与PCR产物进行单碱基延伸反应。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDITOF-MS)技术，检测延伸产物分子质量，应用专用的分析软件，通过判断分子大小的差异进行SNP分型检测。

1.4 PCR扩增引物设计

对5个候选SNPs进行基因型鉴定，使用Sequenom公司Genotyping Tools 及Mass ARRAY Assay Design软件设计待测SNPs 的PCR 扩增引物及单碱基延伸引物，序列见表1。

表1 5个SNP位点引物序列

1.5 质量控制

按以下标准进行质量控制：①所有病例均经过病理确诊；②剔除DNA 总量＜0.6 μg、存在降解、有小片段RNA污染及未能检测出基因型的样本；③芯片分型过程中使用评估信号值分布与背景信号值的差异(Dish QC)对样品进行质控，剔除Dish QC 低于0.82的样品；④基因型的检测和判读采用盲法；⑤芯片检测与MALDI-TOF-MS技术检测进行结果一致性的比较。

本次实验Dish QC 均大于0.82，所有样品都通过质量检测。所有样本选择2%的SNPs 进行重复检测，一致性为98.47%。前两批采用MALDI-TOF-MS 检测的42个SNPs与芯片中的取交集得到5个位点，比较这5 个位点分型结果，发现两种方法检测结果一致性好，且分型失败率低，说明芯片分型结果可靠，如表2所示。

表2 两种检测方法检测相同SNP的一致性情况

1.6 统计学方法

所有实验室数据经复查和核对后应用EpiData3.1软件进行数据录入并建立数据库。采用χ2检验计算对照组的各基因多态性位点分布是否符合H-W平衡，并进行一般人口学资料的均衡性及两组间的SNPs的表达是否有差异的检验；采用Cox Regression 命令拟合条件Logistic模型对单个位点的基因型、等位基因在不同胃癌部位进行单因素Logistic 分析，计算其比值比OR(odds ratio，OR)及95%可信区间(confidential interval，CI)，模型中对相关混在因素进行调整。以上分析均使用SPSS 24.0 软件包完成。所有P 值基于双侧检验，统计学检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 芯片中PI3K/Akt/mTOR 通路基因SNPs 筛选情况

按照上述筛选策略，各步结果如图1。根据基因编码蛋白网络图显示至少与4 个蛋白相互作用(图2)，且Confidence Score＞0.8(表3)筛选得到IRS1、PIK3CD、PIK3R1、AKT1、RPS6KB1、PPP2CA 等 关 键 节 点 基因。与胃癌相关的PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相关关键节点中满足MAF 和H-W 标准的共4 个基因5 个SNPs，分别为IRS1 rs10205233、PIK3CD rs3934934、PIK3R1 rs706711、PIK3R1 rs706714、AKT1 rs35285446，详见表4。

图1 PI3K/Akt/mTOR通路上自噬相关基因筛选结果图

图2 PI3K/Akt/mTOR 通路上与胃癌相关的自噬相关基因编码蛋白网络图

表3 与胃癌相关基因编码蛋白在STRING数据库分析相互作用的综合得分

2.2 PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相关基因SNPs 与胃癌易感性研究

本次选取的5 个SNPs 位点的基因型频率分布在622例对照组中符合H-W平衡(P＞0.05)。Cox回归分析结果显示，在调整了婚姻状况与文化程度之后，IRS1 rs10205233 的多态性变异(C＞T)显著降低了胃癌的发病风险[共显性模型、显性模型的OR(95%CI)分别为0.761(0.595，0.975)、0.764(0.601，0.973)]，进一步分层分析，该位点显性模型、隐形模型、共显性模型以及等位基因在贲门癌和非贲门癌人群中均未见统计学差异(P＞0.05)。此外，尚未发现其余4个位点的共显性模型、等位基因、显性模型及隐性模型与胃癌、贲门癌、非贲门胃癌的发病风险存在关联。结果详见表5～9。

2.3 PIK3R1单体型分析

我们所研究的PIK3R1基因2个多态性位点的连锁不平衡分析(图3)显示2 位点间具有强连锁不平衡关系，2位点共可产生4个单体型SNP位点，排列顺序依次为rs706711、rs706714，结果单体型1、2、3、4 在病例和对照组的分布差异均无统计学意义(P＞0.05)。表10。

图3 rs706711与rs706714之间的连锁关系分析

3 讨 论

细胞自噬的生物学功能在许多类型肿瘤中已得到证实，在细胞废物清除、结构重建、生长发育中起重要作用[9]。自噬的发生是一个复杂的受严格调节的细胞内容物的降解和再循环的动态过程，涉及多条信号通路，并由将近40个自噬相关基因编码的自噬相关蛋白调节[10]。其中PI3K/Akt/mTOR 信号作为一条经典的抗凋亡、促存活通路，其异常激活在肿瘤形成中有着

极其重要作用[11]。Singh 等[12]通过分析PIK3CA、PTEN、mTOR 等分子作用机制，并使用PI3K/Akt/mTOR 通路抑制剂观察胃癌细胞的恶化状态，发现胃癌细胞中存在PI3K/Akt/mTOR 信号通路，推断出使用PI3K/Akt/mTOR 通路抑制剂能改善胃癌细胞恶化状态。此外，Liu 等[13]研究发现，在胃癌细胞中，PI3K/Akt/mTOR 通路相关蛋白的含量较正常细胞多，并且人体对细胞异变的防卫组织会排斥这种蛋白，这也说明该通路蛋白是导致胃癌发生的一个重要原因。由此可知，PI3K/Akt/mTOR 信号通路可调控胃癌细胞的增殖生长，是使胃部细胞恶化的重要通路。但目前尚未见系统性分析自噬通路相关基因与胃癌关联性的研究，因此我们采用SNP 芯片较系统地研究PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相关基因SNPs 与胃癌易感性的关联。

表5 IRS1基因rs10205233位点与胃癌易感性的Cox回归分析

表8 PIK3R1基因rs706714位点与胃癌易感性的Cox回归分析

表9 AKT1基因rs35285446位点与胃癌易感性的Cox回归分析

表10 PIK3R1不同单体型与胃癌遗传易感性的关系

本研究首先通过KEGG 等数据库筛选出45 个PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相关基因极其445 558 个标签SNPs，为了更广泛地筛选自噬通路新基因SNPs，我们将以上所有标签SNPs 与SNP 芯片中的位点做交集，发现有1 304 个PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相关基因SNPs位于芯片中。通过卡方检验后发现有38 个SNPs 基因分型在胃癌病例和对照中分布差异有统计学意义。但这些位点有些在人群中的变异率很低，有些所对应的基因并不直接受调控因素的影响，而是通过基因间相互作用，间接受调控因素变化影响。因此我们进一步通过生物信息学分析筛选出PI3K/Akt/mTOR 通路上可能与胃癌有关联的4 个自噬相关的关键节点基因(IRS1、PIK3CD、PIK3R1、AKT1)及其5个SNPs，然后对其进行大样本验证，最后发现IRS1 rs10205233位点与胃癌的易感性相关，而其他位点与胃癌发病风险无关联，并且5 个位点均未见文献报道与肿瘤相关。

在许多癌症研究中证实，PI3K/Akt/mTOR 信号通路作为联系胞外信号和胞内应答效应的桥梁分子，可对细胞的生长、増殖、凋亡、迁移等一系列的生理功能产生作用，从而影响癌症的发生及转归。Beclin1蛋白在调节自噬起始囊泡形成的过程中起关键作用，Beclin1 是酵母ATG6 在哺乳动物中调节自噬的同源基因，是自噬第一阶段不可或缺的基因[14]，而在Beclin1依赖的自噬中，PI3K 活性在自噬体形成中至关重要[15]。PI3K是一类脂质激酶，其主要的生化功能是促使磷酸肌醇的3-羟基基团磷酸化。研究认为，通过酪氨酸激酶受体、细胞黏附分子、G 蛋白偶联受体等的活化，PI3K 可以催化磷脂肌醇(PI)产生PIP3、PIP4 和PIP5。PIP3 结合并激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB 或Akt)和PDK-1，从而使哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化，进而激活一系列下游信号通路，抑制自噬的发生[16]。mTOR 信号作为调控自噬的一条经典通路，在自噬体的形成和成熟过程中发挥着关键性的作用，同时也具有联系多种自噬调控信号通路的作用，抑制mTOR 信号可使自噬水平提高进而抑制肿瘤细胞的增殖。mTOR 蛋白是一种丝/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，而PI3K/Akt 具有Ser/Thr 激酶的活性，是mTOR 的上游信号。已有大量实验研究证明[17-18]，PI3K/Akt/mTOR 信号通路可调控许多与细胞代谢、凋亡、增殖和分化有关的蛋白，因此该通路上相关基因单核苷酸多态性的改变可能会影响多种蛋白活性，影响通路的生物学功能，进而影响肿瘤的发生与发展[19]。

我们扩大样本量后的病例对照研究发现PI3K/Akt/mTOR 信号通路上IRS1 rs10205233 位点(C＞T)多态性变异降低了胃癌的发病风险。而胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate，IRS1)又是PI3K/Akt/mTOR信号通路的上游信号，Lecker SH 等[20]发现，IRS1/PI3K/AKT1信号通路的启动取决于IRS1的活性，当细胞外的胰岛素信号通过胰岛素受体和IRS1传递到胞内以后，活化的IRS1 激活PI3K，再使其下游的信号分子AKT1 磷酸化，进而将信号传递到mTOR 通路。多项研究表明IRS1 单核苷酸多态性与肿瘤有关[21-22]，如Jung 等[23]的研究发现IRS1 rs1801123、IRS1 rs1801278与年龄等因素的联合作用显著增加了患结直肠癌的风险。因此，我们推测IRS1 rs10205233 位点突变后，使IRS1 转录翻译受阻，无法将信号传递给PI3K/Akt，进而抑制mTOR的激活，引起细胞周期G1期的延缓或阻滞，诱导胃癌细胞凋亡[24]，并提高自噬水平将癌细胞吞噬降解，从而抑制癌细胞的增殖。

rs10205233 位点可能是新的胃癌患者的遗传易感标志物，与福建省胃癌高发区仙游县的胃癌发生发展有关。胃癌的发生发展受到多通路、复杂的级联调控，节点基因交织在一起，形成复杂的调控网络，调节着自噬水平，基因突变容易使其丧失对自噬的调控从而导致胃癌的发生。本研究从信号通路入手，通过Affymeytrix Axiom 芯片技术与生物信息学方法，更科学、有效地筛选出符合要求的基因位点，为胃癌的分子机制研究提供基础资料，为筛查胃癌易感人群和胃癌早期诊断提供基础数据。但同时也需要更多相关的功能性研究来阐明所发现阳性位点的生物学致病机理以及探索更多未知信号通路，绘制全面的胃癌发生发展的信号通路图，更深入地了解自噬相关基因变异在胃癌发生发展中的作用机制。