高迁移率族蛋白B1在小鼠肝再生中对细胞增殖的作用及机制

方从文，石 莹，杜 凤，康秉文，韩明博，殷草草，柏 桦，秦绪军，*

(1.空军军医大学军事预防医学系，特殊作业环境危害评估与防治教育部重点实验室，陕西省自由基生物学与医学重点实验室，陕西西安 710032；2.陕西中医药大学公共卫生学院，陕西 西安 712046)

肝脏作为动物的重要器官，对于维持代谢的稳定性方面发挥着主要作用，它主要由实质细胞(肝细胞)，以及一些非实质细胞(如血窦内皮细胞、库普弗细胞、星状细胞、陷窝细胞等)组成[1]。肝脏不仅具有众多的生理功能，而且其强大的再生能力一直都受到关注[2-3]。它的再生过程关乎多种生长因子和细胞因子，这些因子可以表达于损伤部位或经循环系统进入肝脏，共同形成复杂网络系统参与调控肝再生[4-6]，但调控肝再生过程中细胞增殖的内在机制至今仍不明确。

高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1，HMGB1)是一种普遍存在于哺乳动物细胞内的非组蛋白DNA结合蛋白，它还是细胞感受损伤或炎症刺激后分泌出胞外的信号分子，并且参与形成核小体，可对细胞的众多生物学过程发挥调节作用[7-8]。研究表明，HMGB1不仅能够在肝脏的缺血损伤中作为早期的炎症介质[9]，而且它还是反映药物性肝损伤严重程度的指标之一[10]，提示HMGB1与肝脏损伤和炎症的发生关系密切。而肝再生的进行往往伴随着机体的急性炎症[11]，同时肝再生过程中的细胞处于剧烈的增殖状态[12-13]，那么HMGB1能否作为一种损伤或炎症后的激发产物，对于肝再生中的细胞增殖发挥调控作用，目前对此的相关研究尚不清楚。基于该问题，本研究以70%肝切除术(partial hepatectomy，PH)后的小鼠为模型，通过观察其肝再生过程中胞核内外HMGB1 蛋白表达水平的变化，并以HMGB1 特异性抑制剂丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)[14]进行干预，初步探讨HMGB1对肝再生中细胞增殖的调控作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性BALB/c 小鼠共30 只，质量23～25 g，购于空军军医大学实验动物中心。动物自由饮水饮食，实验环境温度(25±2) ℃，相对湿度(50±10)%，采取12 h常规昼夜循环。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂异氟烷购于RWD 公司；RIPA 裂解液购于碧云天生物公司；BCA蛋白定量分析试剂盒及辣根过氧化物酶二抗购于Thermo 公司；二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)及EP 购于Sigma 公司；兔抗β-actin 抗体购于Bioss 公司；兔抗TLR4 抗体和兔抗RAGE抗体购于Bioworld公司；兔抗LaminB1抗体、兔抗HMGB1 抗体、兔抗NF-κB p65 抗体、兔抗Cyclin D1抗体和兔抗PCNA抗体均购于Abcam公司；核浆蛋白分离试剂盒购于凯基生物公司。

1.2.2 主要仪器R510-11 JJsoflurane 小动物麻醉机、吸收过滤器购于RWD 公司；SCIENTZ-48 高通量组织研磨器购于新芝公司；全自动高速冷冻离心机购于Sigma 公司；Infinite M200 PRO 全波段酶标仪购于Tecan 公司；蛋白电泳仪、蛋白半干转装置、凝胶成像系统均购于Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物造模实验小鼠置于R510-11 JJsoflurane小动物麻醉机中使用异氟烷吸入麻醉，之后参考Higgins 等建立的方法[15]对各组小鼠进行70%肝切除术，将麻醉后的实验小鼠去毛备皮、酒精消毒，取左上腹切口，逐层切开、暴露腹腔，在棉棒的辅助下，轻轻将小鼠肝左侧叶和肝脏中叶挤出，小心离断肝脏周围韧带后使用4-0 线结扎肝蒂，然后在线头上方切除结扎肝叶，剪断线头，即完成70%肝切除术。最后检查无活动性出血后逐层缝合切口，置于复温箱中待动物苏醒。

1.3.2 动物分组和处理先将实验小鼠随机分为7组，即假手术组和6 个不同时间点的PH 组，每组3只。其中，假手术组只打开腹腔暴露肝脏并不切除肝脏，PH 组进行70%肝切除术。PH 组的动物分别于术后第6 小时及第1、2、3、5、7 天处死，并收集肝组织用于之后检测。在干预实验中将小鼠随机分为3组，假手术组、PH 组和EP 干预组，每组3 只，EP 干预组小鼠在70%肝切除术后再每日给予EP 腹腔注射，剂量为40 mg/kg，术后第2 天处死动物、收集肝组织，速冻于液氮后，保存于-80 ℃下备用，之后进行蛋白提取及检测。

1.3.3 肝组织总蛋白提取及定量在冰浴内将中等强度RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂按100∶1∶1的比例配制，充分混匀于4 mL EP管中；并在各管中称取待检测肝组织100 mg，于SCIENTZ-48 高通量组织研磨器中研磨。之后将匀浆液在4 ℃离心机中采取14 000 g离心20 min，进行2次，取中间层即为肝组织总蛋白。按照BCA蛋白定量试剂盒说明书加样，37 ℃孵育30 min，使用Infinite M200 PRO 全波段酶标仪测定各样品吸光度，根据标准曲线和之前的稀释比例计算蛋白含量。

1.3.4 肝组织细胞核浆分离提取及定量参照胞核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒说明书，进行肝组织匀浆、研磨，再通过差速离心法分离组织的胞核蛋白与胞浆蛋白。之后对得到的不同蛋白分别进行含量测定。

1.3.5 Western blot 检测采用30 μg 蛋白上样量进行蛋白电泳1 h，恒压150 V。裁剪适当大小滤纸和PVDF膜分别浸泡在转膜缓冲液和甲醇中，Bio-Rad转膜仪转膜半小时。5%脱脂牛奶封闭条带2 h后，加入适宜比例一抗，4 ℃摇床低速孵育过夜。用TBST洗膜3 次，每次5 min。加入相应的辣根过氧化物酶二抗，室温低速孵育2 h，TBST洗膜4次，每次5 min。将发光液A与发光液B按1∶1比例配制发光液，在膜上均匀滴加，之后使用凝胶成像系统观察、拍照，并采用Bio-Rad Quantity One软件对条带进行定量分析。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 小鼠PH后肝再生过程中肝组织内HMGB1的变化

对比观察各组小鼠进行70%PH后，肝组织内胞核中的HMGB1 蛋白表达水平如图1A、B 所示。其表达水平在术后逐渐升高，与假手术组相比，术后第1 天HMGB1 的表达已出现差异(P＜0.05)。在术后第2 天达到顶峰，之后逐渐回落，恢复至对照组水平。其胞浆的HMGB1 蛋白表达水平如图1C、D 所示，其总体蛋白变化水平与胞核中水平一致。

图1 小鼠PH后肝再生过程中肝组织内HMGB1蛋白表达的变化

2.2 HMGB1抑制剂EP对小鼠PH后肝组织内HMGB1的影响

如图2 所示，小鼠70%PH 后2 d，与假手术组相比，肝组织胞浆与胞核中的HMGB1 蛋白表达水平均明显上升(P＜0.05)。给予HMGB1抑制剂EP干预后，干预组小鼠肝组织内胞核中的HMGB1 的蛋白相对表达水平与PH 组比较差异无统计学意义，但胞浆中的HMGB1蛋白表达水平则明显降低(P＜0.05)。

图2 EP对小鼠PH后第2天肝组织内HMGB1蛋白表达的影响

2.3 HMGB1 抑制剂EP 对小鼠PH 后肝组织内HMGB1及其下游分子的影响

细胞在受到刺激信号时，HMGB1转运出核后能够结合相应的Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)或是晚期糖基化终末产物(receptor of advanced glycation end products，RAGE)受体，从而释放出大量炎性因子，引发炎症[16]，并能够激活下游核转录因子(nuclear factor-kappa B，NF-κB)转导通路[17]，引起NF-κB抑制亚基(IκB)解离和降解，促进NF-κB p65移位入核，以调控靶基因Cyclin D1 等的表达[18]。于是，我们对HMGB1 及其下游分子进行了对比观察。如图3A、B 所示，小鼠70%PH 后，TLR4 与RAGE 的蛋白表达水平都较假手术组出现了上升(P＜0.05)，给予EP干预后，两者表达水平与PH 组比较并未出现明显改变。但对于核蛋白NF-κB p65，如图3C、D所示，PH组较假手术组，该蛋白的核转位水平明显增加(P＜0.05)，在EP干预后，其水平与PH组相比明显下降(P＜0.05)。

图3 EP对小鼠PH后第2天肝组织内HMGB1及其下游分子蛋白表达的影响

2.4 HMGB1 抑制剂EP 干预对小鼠PH 后肝组织内Cyclin D1、PCNA的影响

Western blot 检测结果如图4 所示，小鼠70%PH后，细胞周期素Cyclin D1 与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的蛋白表达水平都相比假手术组出现了上升(P＜0.05)，给予EP 干预后，两者的表达水平则明显降低(P＜0.05)。

图4 EP对小鼠PH后第2天肝组织内Cyclin D1、PCNA蛋白表达的影响

3 讨 论

肝脏的再生可以定义为代偿性增生，即剩余的肝脏组织进行扩大增生以满足机体的代谢需求[19]，其中不仅有细胞中生物酶的合成，还包括有组织内血流再通和结构重排的过程[20]。但目前认为，肝再生的进行主要还是依赖于细胞的增殖过程[21]。有研究表明：当2/3的肝脏被切除后，剩余的二倍体肝细胞会进入细胞周期发生增殖，经过1 周时间就可补偿肝组织的损失[22]。因此，本研究选用了为期1 周的术后观察时间。我们的实验结果发现，在小鼠70%PH 后HMGB1在胞核中的蛋白表达水平，在1 周内呈现出先上升后又逐渐下降的趋势，并且伴随着该蛋白在胞浆中相同趋势的水平变化，提示HMGB1 可能对肝再生中的细胞增殖起到调控的作用。

EP 是一种由丙酮酸与乙醇结合而成稳定的酯化物，它不仅具有抗炎[23]、调节能量代谢[24]、抗凋亡[25]等药理作用，还具有特异性抑制HMGB1的作用[26]。本实验中，我们也选择了EP 作为HMGB1的一种特异性抑制剂来干预HMGB1 的作用。结果发现，PH 组动物的肝组织内胞核、胞浆蛋白中的HMGB1 都出现了明显上升；但在EP 干预后，虽然胞核蛋白中HMGB1相比PH组，没有明显改变，但胞浆蛋白中的HMGB1表达水平明显下降，表明EP 可能是抑制了HMGB1的释放过程。

研究证明，HMGB1 释放出核后，会结合受体TLR4 和RAGE，能够激活下游效应因子NF-κB p65，促使其发生核转位，调控Cyclin D1，并且能够通过参与细胞的信号传导，对多种病理生理过程进行调节，如免疫炎症反应和凋亡等[27]。而PCNA 广泛表达于细胞周期S 期，仅在增殖细胞中合成和表达[28]，与Cyclin D1 两者都是衡量细胞增殖的敏感指标。因此，在该实验中，我们选用了Cyclin D1、PCNA 来观察肝细胞增殖的水平，发现PH 组中的HMGB1 相关受体TLR4 和RAGE，下游效应因子NF-κB p65 及Cyclin D1、PCNA 都明显上升。在给予EP 干预后，虽然HMGB1相关受体水平没有出现明显改变，但通路的下游效应因子NF-κB p65及Cyclin D1、PCNA的蛋白表达水平出现了明显的降低。该结果表明，小鼠在PH后的肝再生过程中，HMGB1转运出核，能够激活下游通路，增加NF-κB p65 的核转位，继而上调Cyclin D1、PCNA 的表达，从而促进了肝再生中细胞的增殖。而在EP 干预后，可以抑制HMGB1及其下游信号通路，对肝再生中细胞的增殖产生抑制作用。

综上所述，我们采用了小鼠70%PH后的肝再生模型，通过观察肝再生过程中HMGB1 的表达水平变化，结合HMGB1特异性抑制剂EP 干预实验，发现了小鼠PH 后会引起HMGB1 的释放，继而激活NF-κB p65 的核转位，调控Cyclin D1、PCNA 的表达，促进了肝再生中细胞的增殖，提示调控HMGB1 信号通路可能会调控肝再生过程。