双侧卵巢切除术建立雌激素缺乏大鼠模型的研究

赵梓妍,张艳丽,常文慧,靳雨月,马建民,丁 怡#

(1潍坊医学院眼科学教研室,潍坊 261053;2潍坊医学院应用药理学实验室;3潍坊医学院病理生理学教研室;4首都医科大学附属北京同仁医院北京同仁眼科中心,北京市眼视光与视觉科学重点实验室;*通讯作者,E-mail:jmma@sina.com;#共同通讯作者,E-mail:dingyi6767@163.com)

雌激素是主要由雌性动物卵巢分泌的类固醇类激素,可促进第二性征的发育及性器官的成熟,对维持性欲和生殖功能起着至关重要的作用。雌激素主要包括雌二醇(17β-estradiol,E2)、雌酮(estrone,E1)和雌三醇(estriol,E3),其中雌二醇的含量最高且生理活性最强[1-6]。雌激素受体分布在子宫、阴道、乳房、盆腔、皮肤、膀胱、尿道、骨骼、大脑和眼等器官。因此,雌激素除了对生殖系统具有生理作用外,对内分泌、心血管、代谢系统、骨骼的生长和成熟、皮肤、眼部附件等均有明显的影响[2-7],雌激素缺乏是许多病变的病因之一。

围绝经期雌激素缺乏模型的建立方法包括手术法、药物法及射线法等多种方法[8]。相比之下,手术法建立雌激素缺乏模型更易掌握,操作准确,损伤较小,成功率更高。目前虽已有少数文献[9]介绍大鼠双侧卵巢切除术,包括腹部正中切口和背侧双切口两种术式,但无详细体表定位,手术操作的描述简单,重复其手术存在困难。本研究选择12周龄雌性SD大鼠,分别采用腹部正中切口和背侧双切口进行双侧卵巢切除,比较其建立雌激素缺乏大鼠模型的优缺点,明确其详细手术操作过程和注意事项,从而获得一种操作简便、成功率高、模拟效果好、结果稳定的模型建立方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

SPF级雌性未经产SD大鼠20只,12周龄,体质量300-320 g,购自济南朋悦实验动物中心(生产卫生许可证号:SCXK(鲁)20140007)。正常饮水,普通饲料喂养。动物房光照环境:14 h光照,10 h黑暗。

雌性SD大鼠随机分为两组:腹部开口双侧卵巢切除术组(10只)和背部开口双侧卵巢切除术组(10只)。

于术前和术后对施行双侧卵巢切除术的20只雌性SD大鼠进行阴道脱落细胞学检查及外周血血清雌二醇含量检测。比较术前和术后差异,以判定雌激素缺乏模型的构建是否成功。

比较两种手术方法的操作难度、切口大小、手术时间、出血量、术后恢复时间、术后并发症以及伤口感染情况。脊柱脱臼法处死大鼠,解剖观察两种术式对大鼠内脏的影响和术后并发腹腔粘连的情况。

1.2 阴道脱落细胞检查

于术前及术后第2周检测大鼠的动情周期。在动情周期内,分别于每日的中午、晚上各取大鼠阴道脱落细胞一次。暴露大鼠阴道口,将蘸有生理盐水的棉棒缓缓送入大鼠阴道,同一方向轻轻旋转棉棒。棉棒上沾有脱落的阴道上皮细胞,将其涂在载玻片上,滴加亚甲蓝溶液对脱落细胞进行染色。染色15 min,后用自来水冲洗、晾干,使用光学显微镜(德国Leica DMi8)观察。

1.3 血清雌二醇的检测

于术前及术后检测大鼠的血清雌二醇含量。根据阴道脱落细胞形态判定大鼠所处的动情周期。术前采血时动情周期内的各个时期均采血一次,检测血清雌二醇含量。术后动情周期消失,以术后12 d为起点,按照术前动情周期各个时期的时间间隔进行采血,即术后12,13,16,17 d各采血一次,检测血清雌二醇含量。尾静脉采血约200 μl,2 000 r/min离心10 min,取上清,2 000 r/min再次离心10 min,分离血清,-20 ℃保存。雌二醇检测前须将所制备的血清样品和检测用试剂(17-beta-雌二醇ELISA试剂盒,Abcam,ab108667)放至室温。按照试剂盒说明书的要求,将25 μl的血清样品、对照品及标准品溶液分别加入酶标板,37 ℃孵育2 h。使用洗板机(上海科华ST-36W)冲洗3次,加入100 μl TMB底物,室温避光孵育30 min,加入试剂盒内的终止液,轻摇,30 min内用酶标仪(上海科华ST-360)测量样品在450 nm处的吸光度。制作标准曲线,计算样品内雌二醇的含量。

1.4 术前准备及术后处理

术前准备，术前1 d禁食。称重,10%水合氯醛(4 ml/kg)行腹腔麻醉,判断麻醉成功后进行备皮。

术后处理给予大鼠40万U/ml青霉素溶液0.1 ml/kg,大腿肌注,连续3 d,并在皮肤切口处滴加适量青霉素溶液。

1.5 背部双切口双侧卵巢切除术

背部双切口的体表定位:因第6腰椎的棘突直立,便于辨认,故选择SD大鼠的髋结节平第6腰椎作为体表标志。左侧卵巢平第4-5腰椎,旁开脊柱2 cm;右侧卵巢位于右侧胸骨下,平第2-3腰椎,旁开脊柱2 cm。以此为体表定位进行手术。

双侧卵巢切除术背部开口术式:大鼠俯卧位,根据双侧卵巢的体表定位进行备皮、消毒、铺单等术前操作。使用剪刀在左侧卵巢的体表定位处打开约1.0-1.5 cm左右的皮肤切口,皮肤撑开器撑开皮肤切口暴露腹膜。切口约0.5-1.0 cm打开腹膜暴露腹腔,可见位于肾脏外下方的脂肪组织,轻微牵拉组织便可看到包裹在脂肪组织里呈淡粉红色的卵巢及紧密相连的输卵管。使用2号手术缝合线结扎卵巢及输卵管并摘除。将剩余组织送回腹腔,使用5-0带线缝合针逐层关闭腹膜,使用三角针及2号手术缝合线缝合皮肤切口(见图1)。同样操作完成大鼠对侧卵巢切除。

1.6 腹部正中切口双侧卵巢切除术

腹部正中切口的体表定位:SD大鼠的子宫属双子宫型,呈长管状,左右各一。上接输卵管,与卵巢一同被脂肪包被;下端,左右子宫汇合,与阴道相接。故阴道口可作为体表标志。于腹部正中线距阴道口2.5 cm处为腹部正中切口的手术定位。

双侧卵巢切除术腹部开口术式:大鼠行仰卧位,根据腹部正中切口的定位进行备皮、消毒、铺单等术前操作。使用剪刀在正中定位处打开约1.5-2.0 cm的皮肤切口,皮肤撑开器撑开皮肤切口可见皮下组织。切开肌肉及腹膜,暴露腹腔。可见脂肪组织,有时可见部分膀胱和小肠。找到子宫,向上探查,并轻柔拉出,其末端可见包裹在脂肪组织里呈淡粉红色的卵巢及紧密相连的输卵管。使用2号手术缝合线结扎卵巢及输卵管并摘除。将剩余组织依次送回腹腔。使用5-0带线缝合针逐层关闭腹膜,使用三角针及2号手术缝合线缝合皮肤切口。同样操作完成大鼠对侧卵巢切除。

A.双侧卵巢的体表定位备皮、消毒;B.切口定位铺单;C.左侧卵巢的体表定位;D.皮肤撑开器撑开皮肤切口,暴露腹膜;E.卵巢、输卵管以及脂肪组织;F.结扎并摘除卵巢及输卵管;G.逐层关闭腹膜;H.缝合皮肤切口图1 背部切口左侧卵巢切除手术过程Figure 1 Left ovariectomy with dorsal incision in SD female rat

1.7 统计学分析

所有数据使用IBM SPSS Statistics 22.0统计软件分析。对两组样本进行两独立样本t检验,P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 背部切口卵巢切除术手术定位及术后解剖关系的确认

背部切口手术定位:大鼠的卵巢由卵巢周围脂肪包被,并由脂肪与肾脏相连。大鼠的左侧肾脏的解剖位置略低于右侧。卵巢毗邻肾脏,解剖位置也呈左低右高。可根据解剖情况明确其体表定位。

术后解剖关系的确认:术后处死实验动物,打开腹腔,可见手术缝线结扎部位、剩余子宫与肾脏的毗邻关系(见图2)。说明手术过程中并没有影响大鼠脏器的毗邻关系,对大鼠影响较小。

A.仰卧位右侧卵巢结扎部位;B.仰卧位左侧卵巢结扎部位;C.仰卧位双侧卵巢结扎部位图2 背部切口双侧卵巢切除术术后解剖关系的确认Figure 2 The anatomic relationship in enterocoelia after the bilateral ovariectomy

2.2 腹部和背部切口卵巢切除术式比较

背部切口可直接暴露卵巢,较腹正中切口入路手术用时短,难度减小。背部开口术式的切口长1.0-1.5 cm,手术时间为1.0 h,术后7-10 d伤口可恢复,无肠梗阻等严重并发症出现。腹部开口术式切口长1.5-2.0 cm,手术时间为1.5-2.0 h,术后10-14 d伤口可恢复,1只大鼠术后并发肠梗阻。背部开口术式的切口小、手术时间短、不易出现并发症,明显优于腹部开口术式(见表1)。

表1 两种手术术式的比较

Table 1 Comparison of the perioperative and postoperative features between the two methods

手术术式操作难度切口大小(cm)手术时间(h)对内脏的影响出血量(ml)术后恢复时间(d)术后并发腹腔粘连切口感染术后并发肠梗阻(只)背部双切口 易1.0-1.51.0 小 0.5-1.07-10轻微无 0腹部正中切口难1.5-2.01.5-2.0较大0.5-1.010-14重 轻微1

2.3 动情周期的确定

大鼠的雌激素水平会随生理周期呈现动态变化。研究结果显示,正常雌性SD大鼠的生理周期为3-5 d,分为动情间期、动情前期、动情期和动情后期。动情前期持续12-21 h,动情期持续9-12 h,动情后期持续9-27 h,动情间期持续57 h左右。但每只鼠的情况不完全相同,有其个体差异。

阴道上皮脱落细胞在各个时期的形态不同。阴道脱落细胞涂片法判断大鼠生理周期所处的时期,使用亚甲蓝染色法对涂片进行染色。各个时期的特点如下:①动情前期:镜下观察可见多个呈椭圆形有核上皮细胞,少量角化上皮细胞,二者比例约为3 ∶1;②动情期:镜下可见满视野的角化上皮细胞,呈落叶状重叠排列,并有少量或无有核上皮细胞;③动情后期:镜下可同时观察到有核上皮细胞、角化上皮细胞及白细胞这三种细胞,但细胞总数明显少于动情前期及动情期;④动情间期:镜下可观察到白细胞及黏液颗粒,偶见有核上皮细胞及角化上皮细胞。

术后2周行阴道脱落细胞涂片检查发现,手术组镜下可见白细胞和黏液颗粒,偶见角化上皮细胞。连续涂片的结果一致,不再出现周期性改变。

2.4 雌性SD大鼠的血清雌二醇含量

卵巢是雌激素分泌的主要来源,通过测定外周血雌激素的水平来评价雌激素缺乏模型建立成功与否。正常SD大鼠在生理周期的不同阶段,外周血雌二醇表达水平不同,动情后期逐渐增长,动情前期达到最高值,动情期下降回到基础值。动情前期雌二醇含量为(70.61±24.19)pg/ml,动情期为(50.51±19.60)pg/ml,动情后期为(53.30±7.57)pg/ml,动情间期为(71.78±14.48)pg/ml。因术后大鼠生理周期紊乱,于术后12,13,16,17 d检测血清雌激素含量(取血时间间隔与正常周期一致),结果显示,外周血雌二醇含量术后12 d为(35.35±9.03)pg/ml、术后13 d为(33.01±8.18)pg/ml、术后16 d为(34.19±7.58)pg/ml,术后17 d为(43.99±6.44)pg/ml。

施行双侧卵巢切除术的20只大鼠于术前、术后检测外周血雌二醇含量,进行统计学分析。术后血清雌二醇含量较术前明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。即大鼠卵巢切除后,其血清雌二醇的水平明显低于术前,且随生理周期的变化不明显,提示雌激素缺乏模型建立成功。

2.5 双侧卵巢切除术后大鼠行为学改变

双侧卵巢切除术后SD大鼠相较术前洗脸次数更频繁,毛色变黄、光泽减退、摄水摄食行为减少。精神状态方面更易烦躁,易激怒,重新合笼后互相撕咬的情况增多。

3 讨论

SD大鼠雌激素缺乏模型的建立有助于探究雌激素的生理功能、绝经期女性潜在疾病的危险因素,以及为药物的药用作用和不良反应的评价提供方法,但现有的文献中,缺乏系统详细的模型建立方法的介绍和双侧卵巢切除效果的评价。

本研究中,对比了双侧卵巢切除两种手术术式,背部切口较腹正中切口入路手术用时短,难度减小。采用腹部正中切口进行手术时,因与子宫毗邻的脏器较多,在进行探查过程中,可能会破坏大鼠正常脏器的毗邻关系,造成肠扭转及腹腔黏连。就出血量而言,两种手术方式出血量无差异,主要出血在分离脂肪及摘除卵巢过程中,约0.5-1.0 ml。总体来说,背部切口入路的手术方式操作更为直观、简便,手术用时少,对大鼠腹腔的其他脏器影响较小,术后腹腔粘连和/或并发肠梗阻的情况较少,手术成功率高。明确背部开口手术的体表定位时,采用了腹部开口解剖大鼠,观察卵巢的位置和毗邻关系,将双侧卵巢固定于背部后,翻转大鼠至俯卧位,明确其在背部的定位和体表标志。之后在实施背部开口双侧卵巢切除术后进行了解剖关系和定位的确认。术后处死实验动物,探查手术缝线结扎部位与剩余子宫及肾脏的毗邻关系,确认是否做到准确和完全切除卵巢。发现手术过程中并没有影响大鼠脏器的毗邻关系,对大鼠腹部脏器影响较小。通过反复试验,发现此操作简单,有较好的可重复性。

通过测定大鼠生理周期和外周血雌二醇的含量对模型进行了效果评价。众所周知,对于女性人群和雌性动物而言,体内雌激素的含量随生理周期处于规律而动态的变化中[10]。女性绝经后将出现雌激素水平的下降和生理周期的紊乱。因大鼠生理周期存在个体差异,时间不一致,导致测定工作量大,绝大多数文献没有对其生理周期和雌二醇含量的变化做过系统研究。本研究中,大鼠术前生理周期的检测结果明确了各时期的持续时间,外周血雌二醇随生理周期出现规律变化。并且发现双侧卵巢切除手术后大鼠出现了生理周期紊乱,阴道脱落细胞没有典型的各期变化,外周血雌二醇的水平明显低于术前,且波动幅度明显减小,说明双侧卵巢切除后,雌激素分泌减少,性周期受影响,达到预期效果,大鼠雌激素缺乏模型建立成功。

为降低手术的动物死亡率,确保建模成功,在模型建立过程中,需要注意以下几个问题。①手术遵循无菌原则。虽大鼠的免疫力相对较强,手术切口较小,但因雌激素相关研究通常要持续一段时间,甚至几月,所以要避免感染对实验的影响。所用手术器械应进行高压灭菌,手术缝线、纱布、针、手套应使用一次性用品,严格遵循手术无菌操作,术后使用抗生素,避免感染。②防止肠梗阻的出现。当进行卵巢摘除操作时,应尽量轻柔,避免牵拉过度而改变肠道的正常解剖位置,导致肠扭转及肠梗阻。尤其是行右侧卵巢切除术时,右侧卵巢位置较高,毗邻肠道,更易出现肠扭转。摘除右侧卵巢时可采取左侧卧位的方式,使卵巢的位置更靠近背侧,便于术者操作。但左侧卧位不利于体表定位,不建议初次行卵巢切除术的术者采取此种体位。此外,术前禁食是必须的,排空肠道可减少出现感染性腹膜炎的几率。③控制饲养环境的温度变化。术后大鼠较为虚弱,避免环境温度出现大幅度变化,影响大鼠的术后恢复。④实行术后分笼饲养。因为大鼠对麻醉的耐受存在个体差异,术后苏醒时间不一致,可能导致互相撕咬,影响恢复。应在术后1-2 d分笼观察,待稳定后可再合笼饲养。

SD大鼠双侧卵巢切除的雌激素缺乏模型是研究卵巢功能低下、雌激素水平低下和缺乏导致许多疾病的重要工具。背部开口的术式具有操作简单、创伤较小、手术可重复性强和成功率高等优势。此模型的成功构建为研究雌激素相关疾病的发病机制、防治和药物评价提供基础研究思路和手段。