阿尔茨海默病认知障碍和全基因组甲基化的关系

刘桂花,李容英,任梦洋,杨晓娟

(山西医科大学第一医院老年病科,太原 030001;*通讯作者,E-mail:yxj2011bs@126.com)

世界人口老龄化加剧,痴呆症已经成为日益严重的公共卫生问题,其中阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是导致痴呆的主要原因，约占60%-70%[1]。预计2050年,全球AD患者将近1.3亿,严重威胁人类健康,并造成沉重经济负担。表观遗传调控衰老和AD的基因表达是目前研究热点[2],尤其对DNA甲基化的研究,可用于分析AD患者遗传因素和环境危险因素之间的关系。本研究选取山西医科大学第一临床医学院收治的AD患者为研究对象,观察AD患者外周血全基因组甲基化水平变化情况。

1 对象和方法

1.1 对象

选择2015-06～2018-10来自山西医科大学第一临床医学院年龄60-85岁的AD患者60例,其中轻度、中度和重度AD组各20例。采用NINCDS—ADRDA标准[3,4],诊断AD,排除严重心肺脑等内科疾病患者。对照组选取同时期年龄、性别及教育水平等相匹配的健康体检老年人60例。本研究对象均签署知情同意书,由山西医科大学医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集 收集基本信息,包括:年龄、性别、教育水平及血压、血糖和血脂水平。

1.2.2 认知水平评估 由神经内科门诊认知评估师统一完成。采用简易精神状态量表(MMSE)进行痴呆的筛查，筛选标准：量表总分文盲≤17分，小学≤20分，初中及以上≤24分可考虑有痴呆。应用临床痴呆评定量表(CDR)进行痴呆严重程度的分级，划分标准：轻度痴呆CDR=0.5-1；中度痴呆CDR=2；重度痴呆CDR=3。

1.2.3 全基因组甲基化测定 从AD患者外周血中提取DNA,将DNA浓度调整为200 μg/L。依据全基因组甲基化检测试剂盒(购于美国Epigentek集团公司)检测DNA的甲基化水平。首先使用阳性对照样品绘制标准曲线,算出斜率,根据公式计算全基因组甲基化水平:

其中,X*为人基因组DNA的GC含量为41%。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组基本资料比较

由表1可知,对照组、轻度AD组、中度AD组、重度AD组在年龄、性别、教育年限及高血压、高脂血症、糖尿病的患病比例方面差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 AD患者与对照组基本情况比较

Table 1 Comparison of basic conditions between AD patients and controls

分组n年龄(岁)性别[男,例(%)]教育年限(年)高血压[是,例(%)]高脂血症[是,例(%)]糖尿病[是,例(%)]对照组6073.37±10.439(65.0)9.45±2.9527(45.0)25(41.7)6(10.0)轻度AD组2072.10±9.8313(65.0)9.85±3.5112(60.0)10(50.0)3(15.0)中度AD组2072.90±9.7214(70.0)8.75±3.2713(65.0) 9(45.0)4(20.0)重度AD组2074.00±8.2313(65.0)9.55±2.7614(70.0)11(55.0)3(15.0) F/χ20.1380.1850.4615.2531.2421.442 P0.9370.9800.7100.1540.7430.696

2.2 两组MMSE评分及全基因组甲基化率比较

对照组和AD组的全基因组甲基化率差异有统计学意义(F=18.627,P<0.001)。进一步两两分析结果显示:轻度AD组、中度AD组和重度AD组全基因组甲基化率低于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05);中度和重度AD组全基因组甲基化率低于轻度AD组,且差异有统计学意义(P<0.05);中度AD组和重度AD组之间全基因组甲基化率差异无统计学意义(P>0.05)。对照组和AD组的MMSE总分值差异有统计学意义(F=59.738,P<0.001),进一步两两分析结果显示,MMSE总分值组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表2 AD患者与对照组MMSE评分及全基因组甲基化率比较

Table 2 Comparison of MMSE score and whole genome methylation rate between AD patients and normal controls

分组n MMSE总分 全基因组甲基化率(%)最小值最大值x±s 对照组6026.83±2.7911.4341.8822.0±7.1轻度AD组2022.30±3.55a10.3437.1718.2±5.9a中度AD组2015.35±7.21ab5.3426.6613.1±5.7ab重度AD组20 8.35±10.62abc5.9422.8311.7±5.1ab F-59.738 --18.627 P-<0.001--<0.001

与对照组相比,aP<0.05;与轻度AD组相比,bP<0.05;与中度AD组相比,cP<0.05

2.3 全基因组甲基化率与MMSE评分相关性分析

全基因组甲基化率与MMSE评分相关性分析结果显示,两者之间存在正相关关系,即随着全基因组甲基化率的升高,MMSE总分值也随之升高,两者相关系数为0.493(P<0.001,见图1)。

图1 60例AD患者全基因甲基化率与MMSE评分散点图Figure 1 Scatter plot of whole genome methylation rate and MMSE score in sixty AD patients

3 讨论

阿尔茨海默病患病率不断上升,但AD的诊断还存在很多的分歧,能否准确并及时地诊断是对AD进行干预的前提。Mastroeni等[2]研究证实:在衰老和AD患者中DNA甲基化水平降低。最新研究表明,AD患者在学习记忆相关的脑域，比如颞叶皮层[5]和海马[6]呈全基因低甲基化水平、CpG岛DNA呈高甲基化水平[7]，但另有研究在AD患者相同脑区却观察到相反的DNA甲基化结果[8,9]，虽然不同研究观察到的甲基化水平不同，但无疑这些结果都显示出基因甲基化与AD存有密切关系。但另有研究在AD患者相同脑区却观察到相反的DNA甲基化结果[8,9],进而导致认知障碍。需要指出的是:DNA甲基化的检测具有组织特异性,也就是说脑组织和外周血中的检测有差别,而在临床中我们只能观察外周血的甲基化水平变化情况。但有学者认为AD患者外周血中相应基因的表达水平与脑组织中的表达具有平行性[10]。外周血全基因组甲基化检测,操作简易,类ELISA法,是一种非侵入性的、易于测量的外周生物标志物,将在人群诊断筛选中具有重大的实用价值。

在迟发型AD(LOAD)中,表观遗传修饰发挥作用。在一项系统回顾分析中指出[11]:48项研究中,67%的研究证实了DNA甲基化与认知水平呈正相关,并预测外周血DNA甲基化将会成为判断痴呆发生及加剧的生物标志物。本次实验检测的是AD患者的外周血,采用的是全基因甲基化检测试剂盒,结果提示AD患者外周血全基因组甲基化率降低,并随着AD认知水平的减退,全基因组甲基化率持续下降,差异有统计学意义。采用Pearson相关性分析,随着全基因组甲基化率的降低,MMSE总分值也随之降低,两者相关系数为0.493(P<0.001)。Chouliaras等[12]发现:在AD患者海马组织中,DNA甲基化(5mC)和羟甲基化(5hmC)是降低的。Condliffe等[13]进一步证实了在AD患者的内嗅皮层和小脑内5-hmC也是减少的。Bollati等[14]发现,AD外周血中LINE-1基因甲基化与认知水平成正相关。在体外细胞研究中,Chen等[15]提出:全基因组甲基化减低,可能与AD相关的特定基因(如APP,BACE1基因等)甲基化降低有关,APP基因、BACE1基因甲基化降低,会加速转录,β-淀粉样蛋白增加，导致Aβ脑内沉积，另一方面，Aβ增多也能促进全基因组甲基化的降低，进而形成恶性循环。这些实验都支持本次实验结果，但Di Francesco等[16]使用荧光甲基化分析法检测AD患者外周血全基因甲基化水平却升高。这可能与样本量少、实验处理方法不同有关。

课题组前期动物实验研究结果表明:应用麦芽酚铝制备AD大鼠,发现大鼠海马组织全基因组甲基化率降低,使用叶酸干预后,全基因甲基化率有所改善[17]。提示全基因组甲基化降低也是AD重要的可干预危险因素。叶酸的缺乏和高同型半胱氨酸导致全基因组低甲基化,而在补充叶酸后部分低甲基化能逆转[14]。在AD病情进展过程中,我们可以通过干预提高致病基因的甲基化和降低抑病基因的甲基化水平,即通过控制DNA适度甲基化来起到防治AD的目标。

因此,我们在临床及研究工作中,检测外周血全基因组甲基化差别可以对AD进行预防、早诊断及治疗。但是,我们的研究结果还需要通过增大样本量和采用焦磷酸测序仪来进一步的验证。