右美托咪定对机械拉伸A549细胞IL-8和PAI-1表达及细胞凋亡率的影响

孙 丽,岳 帅,任俊明,郭永清*

(1山西医科大学麻醉教研室,太原 030001;2山西医科大学附属人民医院麻醉科;*通讯作者,E-mail:gyq106968@aliyun.com)

机械通气已被广泛应用于急性肺损伤的治疗,可以提供一定水平的通气量以改善肺泡通气,改善氧合。然而,机械通气作为一种牵张刺激,长时间机械通气可将牵张损伤转变为生物伤,促进炎性细胞因子表达增多,即机械通气所致肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)[1,2]。临床研究表明,盐酸右美托咪定(dexmedetomidine)是一种α2-肾上腺素受体激动剂,具有镇静、镇痛、抗焦虑的作用,不良反应较少,对重要器官有保护作用,是一种临床常用的麻醉辅助药物[3,4]。

体外培养A549细胞并连接细胞应力加载装置进行机械拉伸可模拟机械通气所导致肺损伤发病过程[5]。据研究显示,右美托咪定对牵拉刺激所导致肺损伤有保护作用[6],可以降低由于机械因素引起大量炎性因子的释放和弥漫性的肺损伤[7,8]。本实验拟培养A549细胞株,并连接Flexercell-4000TM细胞柔性基底加载系统,建立体外周期性机械拉伸所致A549细胞损伤的实验模型,探讨不同浓度右美托咪定对A549细胞凋亡率变化和PAI-1、IL-8表达的影响,在细胞水平探讨右美托咪定对A549细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

A549细胞(中国科学院上海库),盐酸右美托咪定(2 ml ∶200 μg江苏恒瑞制药有限公司),胎牛血清(Gibco,美国),二甲基亚砜(北京金泰宏达,中国),0.25%胰蛋白酶消化液(北京索莱宝,中国),ELISA试剂盒(上海西唐,中国),MTT(Sigma美国),Annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒(生工生物,上海),BioFlex 6孔培养板(BioFlex公司,美国),二氧化碳细胞培养箱(Thermo Scientific,美国),Flexercell-4000TM细胞柔性基底加载装置(Flexercell International,美国),BD FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson,美国)等。

1.2 细胞株及细胞培养

采用A549细胞株(中国科学院上海库供),以约0.5×105/m2的密度接种于含10%小牛血清的BioFlex 6孔完全培养基上(BioFlex公司,美国),置于37 ℃、湿化5% CO2培养箱中继续培养,每天更换培养液,接种48 h后弃去培养皿中培养液,加入胰蛋白酶进行消化,制备细胞悬液。

1.3 实验分组

①随机将A549细胞随机分为非机械拉伸组和机械拉伸组,每组分为4个亚组:0 h组、4 h组、12 h组和24 h组。机械拉伸组与Flexercell-4000TM拉伸装置连接,非机械拉伸组不与拉伸装置连接。

②随机将A549细胞分为预处理对照组和预处理拉伸组，每组分为4个亚组，机械拉伸前20 min滴加不同浓度右美托咪定(0，0.01，0.1，1 μmol/L)预处理并持续作用24 h。预处理拉伸组与体外细胞应力加载装置连接，预处理对照组不与拉伸装置连接。

1.4 A549细胞机械拉伸损伤模型

将机械拉伸组A549细胞接种于BioFlex 6孔培养板,置于Flexercell-4000TM细胞牵张拉伸应力加载装置(Flexercell International公司)进行拉伸,A549细胞应力加载装置设定为拉伸幅度20%,频率0.3 Hz,波形为正弦波。非机械拉伸组A549细胞同样接种于BioFlex 6孔培养板上并同机械拉伸组细胞培养方式相同,但不与拉伸装置相连。下续实验将A549细胞接种于Bioflex 6孔培养板上,实验组与体外细胞应力加载装置连接,对照组A549细胞与实验组培养方式相同,但不与拉伸装置连接。将A549细胞接种于Bioflex 6孔培养板上，预处理拉伸组与体外细胞应力加载装置连接，预处理对照组A549细胞与预处理拉伸组培养方式相同，但不与拉伸装置连接。

1.5 MTT法测定A549细胞存活率

将A549细胞进行消化,反复吹吸后接种于96孔培养板,每孔加入MTT试剂100 μl,继续培养,每孔加入DMSO中止反应并振荡10 min,检测各组A549细胞在波长为570 nm处的吸光度值。

1.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞术检测A549细胞凋亡率

A549细胞拉伸完毕后,随即每孔加入不含EDTA的0.3%胰蛋白酶0.5 ml,消化10-15 min,PBS洗涤2次,收集细胞,用Binding Buffer缓冲细胞致0.5×105/m2的密度后,加入5 μl Annexin Ⅴ-F ITC,10 μl PI染液混匀,避光孵育20 min,应用流式细胞仪(山西医科大学实验室提供)检测细胞凋亡情况。

1.7 PAI-1和IL-8表达的测定

拉伸完毕后收集A549细胞上清液，取出相对应的条板并加入标准品和被测样品，按照说明对PAI-1和IL-8进行检测，在450 nm波长下测定各孔的OD值，以标准品浓度为横坐标，测定OD值为纵坐标，利用EXCEL在双对数坐标上绘制标准曲线，通过被测样品的OD值在标准曲线上查出其浓度。

1.8 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差表示;多组间比较采用单因素方差分析和LSD检验,配伍组间采用独立样本t检验,以α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 机械拉伸时间对A549细胞存活率的影响

将A549细胞接种于Bioflex培养板20%机械拉伸4,12,24 h,机械拉伸组与各自的非机械拉伸组相比,A549细胞存活率表达水平均下调(P<0.05),且随着时间延长而机械拉伸和非机械拉伸组存活率逐渐降低(P<0.05,见表1)。

表1 不同组间细胞存活率的比较

Table 1 Comparison of cell viability expression between different groups

组别0 h4 h12 h24 h非机械拉伸组87.89±0.2073.89±0.56b66.32±2.67b45.89±1.33b机械拉伸组 87.89±0.2055.89±0.75ab40.99±0.07ab23.89±3.46ab

与非机械拉伸组相比,aP<0.05;与0 h组相比,bP<0.05

2.2 不同机械拉伸时间对A549细胞中PAI-1和IL-8表达水平的影响

应用ELISA检测细胞IL-8结果显示,与非机械拉伸组相比,4,12,24 h机械拉伸组IL-8表达水平明显上调,差异有统计学意义(均P<0.05),且随拉伸时间的延长,非机械拉伸组和机械拉伸组炎性因子IL-8表达水平逐渐升高(P<0.05,见表2)。

表2 不同组间IL-8表达水平的比较

Table 2 Comparison of IL-8 expression between different groups

组别0 h4 h12 h24 h非机械拉伸组3.79±0.237.83±0.29b9.23±0.25b12.75±1.09b机械拉伸组 3.79±0.2336.76±0.23ab91.88±0.98ab151.67±2.51ab

与非机械拉伸组相比,aP<0.05;与0 h组相比,bP<0.05

应用ELISA检测细胞PAI-1结果显示,机械拉伸4 h和12 h,机械拉伸组与非机械拉伸组相比,PAI-1表达差异无统计学意义(P>0.05),但机械拉伸24 h组PAI-1表达上升近一倍(P<0.05)。随着拉伸时间延长,非机械拉伸组PAI-1表达上调无统计学差异(P>0.05),但机械拉伸组24 h时PAI-1表达水平显著升高(P<0.05,见表3)。

表3 不同组间PAI-1表达水平的比较

Table 3 Comparison of PAI-1 expression between different groups

组别0 h4 h12 h24 h非机械拉伸组0.51±0.360.52±0.360.52±0.020.52±0.02机械拉伸组 0.51±0.360.54±0.260.79±0.030.98±0.49ab

与非机械拉伸组相比,aP<0.05;与0 h组相比,bP<0.05

2.3 不同浓度右美托咪定预处理对24 h机械拉伸A549细胞凋亡率的影响

采用Annexin-V/PI检测细胞凋亡率,预处理对照组采用0，0.01，0.1，1 μmol/L右美托咪定处理后A549细胞凋亡率分别为(12.99±0.27)%，(4.78±0.81)%，(2.71±0.66)%和(2.09±1.36)%；预处理拉伸组0，0.01，0.1，1 μmol/L右美托咪定处理后细胞凋亡率依次为(23.67±1.52)%，(15.72±0.06)%，(13.11±1.41)%和(3.68±0.75)%。预处理对照组和预处理拉伸组内与0 μmol/L比较，0.01，0.1，1 μmol/L右美托咪定处理后A549细胞凋亡率明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。预处理拉伸各浓度组细胞凋亡率较各自预处理对照组升高,差异有统计学意义(均P<0.05)，且随右美托咪定浓度的增加细胞凋亡率逐渐减少，呈现剂量依赖性，以1 μmol/L为著(见图1)。

图1 不同浓度右美托咪定对细胞凋亡的影响Figure 1 Effect of different concentrations of dexmedetomidine on cells apoptosis in two groups

2.4 不同浓度右美托咪定预处理对24 h机械拉伸A549细胞PAI-1和IL-8表达水平的影响

ELISA法测定结果显示,预处理拉伸组内与0 μmol/L比较，0.01，0.1，1 μmol/L预处理后PAI-1和IL-8的表达均明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)；随着右美托咪定浓度增加，PAI-1、IL-8的表达逐渐下调，呈现剂量依赖性，以1 μmol/L最显著。预处理对照组不同剂量右美托咪定预处理后PAI-1表达有明显下调(P<0.05)，但IL-8表达变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。预处理拉伸各浓度组A549细胞PAI-1和IL-8表达均高于各自预处理对照组(P<0.05见图2)。

与预处理对照组相比，#P<0.05;与0 μmol/L组相比，*P<0.05图2 不同浓度右美托咪定组间PAI-1和IL-8表达水平的比较Figure 2 Comparison of PAI-1 and IL-8 expression between different concentrations of dexmedetomidine groups

3 讨论

目前机械通气可诱发机械牵张肺损伤,促进各种炎性细胞因子和炎性介质表达增多,并释放细胞因子和炎性介质,诱发炎性反应的级联瀑布效应,通过直接或间接的途径造成机械通气肺损伤(ventilator-induced lung injury)[9,10]。不恰当机械力不仅可造成气压伤和肺不张,还可以引起各类酶原激活,细胞因子和炎性介质的大量释放,甚至导致细胞凋亡[11,12]。大量基础实验表明右美托咪定通过抑制细胞凋亡,抑制交感神经活性和炎症反应多种途径发挥对脑、心脏、肺等发挥保护作用[13]。本实验在细胞水平通过对细胞凋亡和PAI-1、IL-8测定,检测右美托咪定对机械拉伸肺损伤的保护作用。

本研究以A549细胞为研究对象,应用Flexercell-4000TTM细胞牵拉应力加载装置建立离体细胞周期性机械拉伸肺损伤模型[14]。结果显示,与非机械拉伸组相比,机械拉伸组A549细胞存活率显著下调,随着拉伸时间延长,细胞存活率逐渐下降,PAI-1和IL-8表达随机械拉伸时间的延长逐渐上调,以机械拉伸24 h组上调最明显,提示机械拉伸诱发A549细胞损伤,且随着拉伸时间延长,存活率和炎性因子表达变化逐渐显著。用右美托咪定预处理后,再以同样条件对A549细胞施以机械拉伸,可下调A549细胞凋亡率、PAI-1和IL-8表达,随着右美托咪定浓度增加,A549细胞凋亡率逐渐减低,PAI-1和IL-8表达上调逐渐减低,以1 μmol/L组表达水平为著。本实验证明,右美托咪定可减轻机械拉伸诱导下细胞凋亡和炎性因子PAI-1和IL-8的募集和表达,抑制炎症反应启动,减轻机械拉伸肺上皮细胞损伤,从而对A549细胞发挥保护作用。

综上,本实验成功构建了A549细胞体外周期性机械拉伸损伤模型,从细胞力学层面研究机械拉伸诱发肺上皮细胞损伤过程,探讨右美托咪定对人肺Ⅱ型上皮细胞的保护作用,观察不同浓度的右美托咪定对机械拉伸时A549细胞中细胞凋亡率和PAI-1、IL-8表达的影响。根据实验结果提示右美托咪定对抑制机械拉伸所致肺损伤有重要作用,能部分阻断肺部和全身的炎症反应从而减轻肺损伤,对肺脏起到一定保护作用,但与右美托咪定的应用剂量相关。然而,其分子机制目前尚未完全明确,有待进一步研究。