缺氧诱导下骨肉瘤细胞中肾上腺髓质素的表达

戴 星,杨康平,尹战海,马 巍,杨益民,张党锋,周晓玲,姚 璐,2*

(1西安交通大学第一附属医院骨科,西安 710061;2西安交通大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系;*通讯作者,E-mail:lyao1117@xjtu.edu.cn)

肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)作为一种内源性血管活性肽,最早从人嗜铬性细胞瘤中发现并分离出来[1],属于降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)家族成员[2],在人体中分布广泛,几乎各个组织器官中都可以找到它的身影[3]。ADM的生理作用表现为强大的血管扩张作用,静注ADM可引起全身血管阻力下降且呈剂量依赖性,这种降压作用在ADM处于生理浓度时就表现出来[4]。但在病理状态下,实体肿瘤由于生长迅速使得肿瘤组织内部氧分压极低,肿瘤组织的缺氧状态是否激活ADM的过度分泌,而ADM如何促进肿瘤微血管的增生,从而带来更多的氧气和营养物质改善肿瘤微循环,目前尚不明确。本研究中,我们将通过缺氧诱导条件下培养MG-63骨肉瘤细胞,观察在缺氧条件下骨肉瘤细胞中ADM表达情况,并同时检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,分析两者之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

MG-63骨肉瘤细胞系,由西安交通大学医学院中心实验室冻存,复苏后使用。1640培养基、胎牛血清、DMSO和Trizol购自Gibco公司(美国)。0.25%胰酶,RIPA裂解液,购自碧云天生物科技研究所。PrimeScript®RT reagent Kit购自TaKaRa公司(日本)。ADM抗体、VEGF抗体和GAPDH抗体,购自Abcam公司(英国)。

1.2 MG-63细胞培养及缺氧诱导

MG63细胞使用DMEM高糖培养基(含有10%胎牛血清,1%青链霉素),放置在37 ℃,5% CO2的培养箱培养,当细胞密度达到70%-80%时进行传代培养。取处于对数生长期的MG-63细胞,光镜下观察细胞状态正常后,将其消化并传代,待其铺满整个瓶底面积50%-60%时,分为4组:正常培养组、6 h缺氧诱导组、12 h缺氧诱导组和24 h缺氧诱导组。每组设置3个复瓶,实验重复3次。即当实验开始时,把正常培养组置于普通培养箱中,同时把24 h缺氧诱导组细胞置于缺氧培养箱(Electrotk公司,英国),12 h后再将12 h缺氧诱导组细胞置于缺氧培养箱,18 h后在将6 h缺氧诱导组细胞置于缺氧培养箱,缺氧培养箱条件设定为:5% CO2,94% N2和1% O2。待实验开始24 h后统一取出各组细胞,预冷PBS缓冲液洗涤3次后裂解细胞,提取细胞总RNA和总蛋白待进一步检测。

1.3 real-time PCR法检测MG-63细胞中ADM和VEGF mRNA表达

1.3.1 Tri-Zol法提取细胞总RNA 取各处理组细胞,预冷PBS缓冲液洗涤细胞3次后,按每10 cm2面积加1 ml Trizol试剂的比例,加入Trizol裂解细胞,反复吹吸震荡多次。Trizol与氯仿按5 ∶1比例加入氯仿,剧烈振荡15 s后于室温放置3 min。4 ℃,12 000 r/min离心15 min,混合物分为两相;将上层透明溶液移至新离心管中,上层液加入等量异丙醇后于室温放置10 min;4 ℃,12 000 r/min离心15 min。管侧和管底可见胶状沉淀形成。弃去上清,加入1 ml 75%乙醇,剧烈涡旋震荡混匀。4 ℃,75 000 r/min离心5 min,弃去上清,室温下晾干沉淀;50-100 μl RNA溶解液溶解沉淀。紫外分光光度仪测定RNA浓度,样品于-80 ℃保存备用。

1.3.2 引物设计和real-time PCR 使用PrimeScript®RT reagent Kit(TaKaRa,日本)逆转录试剂盒,建立如下的反应体系:5×buffer 2 μl,RT Enzyme Mix 0.5 μl,Random 6 mers(100 μmol/L) 0.5 μl,Oligo dT Primer(50 μmol/L) 0.5 μl,Total RNA 2 μl,最后加入Rnase Free dH2O至总体积为10 μl。反转录反应条件如下:37 ℃,15 min(反转录反应),共3次,85 ℃,5 s。然后将得到的RT反应液加入到下一步的real time PCR反应体系。

依次加入下列试剂,建立如下的反应体系:SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl,PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μl,PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μl,ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.4 μl,RT反应液2 μl,最后加入Rnase Free dH2O至总体积为20 μl。按如下引物序列进行扩增(见表1)。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因上游引物 下游引物 扩增片段(bp)ADM5′-TGCCCAGACCCTTATTCGG-3′5′-AGTTGTTCATGCTCTGGCGG-3′115VEGF5′-GCACCCATGGCAGAAGG-3′5′-GGGGTACCCCTCACCGCCTCGGCTTGTC-3′105GAPDH5′-CAAATTCCATGGCACCGTC-3′5′-CCCATCTGATTTTGGAGGGA-3′101

按两步法实施PCR扩增标准程序。预变性反应条件:95 ℃,30 s,重复1个循环;PCR反应条件:95 ℃,3 s;80 ℃,30 s,重复40个循环。反应完成后电脑上直接读取Ct值,按照2-ΔΔCt法计算并相对定量。计算公式为:ΔΔCt=(Ct目的基因-CtGAPDH)实验组-(Ct目的基因-CtGAPDH)对照组。每实验组设置3个复孔并设置阴性对照,实验在相同条件下重复3次。

1.4 Western blotting检测ADM和VEGF蛋白表达

预冷PBS缓冲液洗涤细胞后,每瓶细胞加入400 μl RIPA混合裂解液,冰上放置10 min后,使用细胞刮收集细胞裂解物。4 ℃,14 000 r/min离心20 min,提取细胞中的总蛋白。取10 μl蛋白用于BCA法的蛋白含量测定。将标准品0,1,2,4,8,12,16,20 μl分别加入至96孔板,每管中另加入200 μl BCA工作液。用酶标仪检测A562的OD值,根据得到的OD值编制标准曲线,计算样本的蛋白浓度。

将已定量的蛋白样品5份加1份6×loading buffer充分混合,使100 ℃加热5 min,让蛋白变性。制备聚丙烯酰胺凝胶用于SDS-PAGE电泳,上样量为50 μg待测蛋白溶液体积,设置电泳条件:时间1.5-2 h,电压90-120 V,至溴酚兰跑出即可终止电泳。采用湿转法进行转膜,完毕后放置5%脱脂牛奶中,摇床孵育1 h。

将ADM兔抗人单克隆抗体及VEGF兔抗人单克隆抗体用TBST配制的5%脱脂牛奶稀释至1 ∶1 000,同时将兔抗人β-actin单克隆单抗用TBST稀释至1 ∶2 500后分别与含有目的条带的PVDF膜4 ℃孵育过夜。同法稀释制备鼠抗兔二抗(1 ∶5 000)室温孵育2 h。将化学发光试剂盒中的A、B两种试剂等体积混合与二抗孵育TBST洗涤后的膜充分接触。采用凝胶图像处理系统采集并分析条带的光密度值以明确目的蛋白的表达量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 缺氧诱导对ADM和VEGF mRNA表达的影响

提取各处理组MG-63细胞总RNA,real-time PCR检测其ADM和VEGF mRNA的表达情况如下:反应的扩增曲线提示曲线拐点清楚,指数期明显,扩增曲线整体平行性好,基线平无上扬现象(见图1);曲线与曲线间平行性非常好,说明各反应管扩增效率相近。反应的溶解曲线显示无异常峰的存在,扩增产物单一,无引物二聚体等其他非目的性产物(见图2)。正常培养组和不同的缺氧诱导组的MG-63细胞均有ADM和VEGF mRNA的表达(见表2)。将正常培养组的ADM和VEGF mRNA表达量设置为“1”。与正常培养组相比,缺氧6 h组的ADM mRNA表达已有明显增加。缺氧诱导时间延长至24 h时,ADM mRNA表达最强。ADM mRNA的表达强度与作用时间呈非线性的正相关关系,组间差异有统计学意义(P<0.05)。与ADM的表达类似,在缺氧的刺激下MG-63细胞的VEGF mRNA表达增强,并随着缺氧时间延长而进一步加强,在24 h时间点达到正常组表达量的2.46倍,组间差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 Real time PCR反应检测ADM和VEGF mRNA的扩增曲线Figure 1 Amplification curve of ADM and VEGF mRNA detected by real time PCR

图2 Real time PCR反应检测ADM和VEGF mRNA的溶解曲线Figure 2 Dissolution curve of ADM and VEGF mRNA detected by real time PCR

表2 RT-PCR检测缺氧下MG-63细胞ADM和VEGF mRNA相对表达量

Table 2 Relative expression of ADM and VEGF mRNA in MG-63 cells by RT-PCR

组别ADM mRNA相对值VEGF mRNA相对值正常培养组 1.00±0 1.00±0缺氧6 h组 1.28±0.06 1.22±0.16缺氧12 h组 1.96±0.14∗ 1.77±0.19∗缺氧24 h组 3.03±0.18∗ 2.46±0.23∗

与正常培养组相比,*P<0.05

2.2 缺氧诱导下ADM和VEGF蛋白表达增强

提取各组MG-63细胞的总蛋白,Western blotting检测MG-63细胞中ADM和VEGF蛋白的表达情况,结果发现各组细胞均有ADM蛋白表达,相对于正常培养组,缺氧诱导各组细胞的ADM蛋白表达增强(见图3)。其中缺氧诱导24 h组细胞表达ADM的量为最强,组间差异有统计学意义(P<0.05)。与ADM的表达类似,在缺氧的刺激下MG-63细胞的VEGF蛋白表达增强,并随着缺氧时间的延长进一步增强,在24 h缺氧时VEGF表达最强,组间差异有统计学意义(P<0.05)。检测各组细胞ADM和VEGF蛋白的相对表达量,将正常培养组的ADM和VEGF蛋白表达量设置为“1”。结果表明在缺氧诱导培养下,可刺激MG-63细胞中ADM和VEGF的表达,并且随着缺氧诱导时间的延长,两者的表达同步增强(见图3)。

与正常培养比较,*P<0.05图3 Western blotting检测缺氧诱导不同时间MG-63细胞的ADM和VEGF蛋白表达情况Figure 3 ADM and VEGF protein expression in MG-63 cells induced by hypoxia at different time points by Western blotting

3 讨论

肿瘤在宿主内通常具有诱导新生血管生成能力,肿瘤组织可以产生和分泌血管扩张与血管生成性物质,而这可能是肿瘤生存所必需的方式[5]。通常正常组织的氧分压在24-60 mmHg[6],而在实体性肿瘤中,由于肿瘤的快速增长超过了肿瘤血管的供应能力,常常使肿瘤中心部位处于缺氧状态,此时肿瘤组织的氧分压只有5 mmHg左右[7],缺氧状态有可能刺激肿瘤细胞过度产生和分泌ADM。

本实验在缺氧的条件下培养MG-63细胞,在不同的缺氧诱导时间点,分别使用real time-PCR和Western blotting检测ADM mRNA和蛋白的表达情况,相对于常氧条件下,缺氧诱导的各组细胞的ADM表达更强,缺氧诱导6 h后ADM表达即有明显差异,随着缺氧时间的延长,ADM表达在24 h达到最强,ADM的表达与缺氧诱导的时间呈正相关关系,蛋白水平和基因水平的检测得到了相似的结果。ADM是一种强效而持久的血管扩张肽,但深入的研究发现它的作用不仅仅局限于扩张血管。ADM可以抑制内皮细胞的凋亡,促进新生的血管生成,并影响血管的张力和渗透性[8]。ADM通过介导血管内皮细胞,激活蛋白激酶B,分裂素活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶1/2以及成簇黏附激酶而发挥血管生成作用[9]。先前的研究一直认为只有血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)和血管生成素(angiopoietin)才对血管生成有明显的促进作用[10],但是如今ADM作为潜在的肿瘤血管生长因子已经引起了研究者的关注。

Dong等[11]的研究发现,观察去势以后大鼠的前列腺组织,发现使用ADM后,其前列腺组织的血流明显增强。进一步的深入研究还发现如果使用特异性ADM抗体,则前列腺组织的血流明显增强的作用将不复存在[12]。外源性添加VEGF也能得到相似的结果,同样的ADM抗体也可以阻断VEGF的这种血流增强效果[13]。Benyahia等[14]在人体外培养血管内皮细胞和成纤维细胞,通过添加外源性的ADM发现可明显增强VEGF诱导的毛细血管生成。以上的研究发现都支持ADM能够增强肿瘤组织的血管化,因此我们提出科学假设:ADM可能通过上调VEGF的表达实现促进血管生成和新生血管形态形成,从而达到缓解肿瘤组织的缺氧状态。

目前关于骨肉瘤细胞在缺氧状态下ADM的表达情况,尚无相关研究。故本实验采用缺氧诱导培养MG-63细胞,从蛋白和基因水平检测结果来看,随着ADM的表达增强VEGF呈现相同的表达趋势,缺氧诱导6 h后相比对照组VEGF表达即有明显差异,随着缺氧时间的延长,VEGF的表达在24 h达到最强。初步证明了骨肉瘤细胞中ADM在缺氧条件下表达被激活,并且随着缺氧诱导时间的延长,ADM和VEGF的表达同步增强,为下一步验证科学假设(ADM通过上调VEGF的表达参与肿瘤新生血管的生成)奠定了实验基础。