表观扩散系数与缺氧诱导因子-1α、核因子-κB在布加综合征大鼠模型中的相关性初探

朱楠，张甜甜，成德雷

（1.安徽省五河县人民医院 影像科，安徽 蚌埠 233300；2.安徽省立医院 介入放射科，安徽 合肥230001）

布加综合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）是肝静脉（hepatic vein，HV）和（或）其开口以上的下腔静脉（inferior vena cava，IVC）阻塞导致的淤血性肝损伤，若不及时治疗，最终可进展为肝硬化[1-2]。既往研究发现，缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是调节BCS病理损伤的重要因子，其在BCS病程中参与调节肝星型细胞活化、细胞外基质沉积、微循环灌注等[3-4]，这些均影响细胞内外水分子弥散，理论上可早于肝脏形态学变化而被表观扩散系数（apparent diffusion coefficient，ADC）检测[5]。已有报道ADC值在评估脂肪肝、乙肝后肝硬化等肝损伤中的价值[6]，但目前在BCS中的研究报道较少。因此，本研究参照既往文献建立大鼠BCS动物模型[4]，动态检测IVC结扎后肝脏ADC值与HIF-1α、NF-κB的变化，初步探讨其在BCS肝损伤中的相关性。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

本研究经安徽省立医院伦理委员会批准（编号：20170104），自安徽省立医院动物实验中心购买体质量235～305 g的健康雄性SD大鼠135只[许可证号：SCXK（苏）2005-0001]，在12小时明/暗交替光照下，温度15～25 ℃，湿度50%～60%条件下清洁饲养。

3F微导管（日本泰尔茂），RevertAidTM逆转录试剂盒（Thermo Scientific公司），ECL超敏发光试剂盒（Thermo公司），HIF-1α、NF-κB一抗均为兔抗1:300稀释（ZSbio公司），PBS液（ZSbio公司），β-Actin（Santa Cruz公司），PicTureTM检测试剂（Zymed公司），山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG购自ZSbio公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及BCS模型制备：按数字表法将135只大鼠随机分为3组：正常组15只；模型组和假手术组各60只，分为术后1、4、8、12周4个亚组，每亚组15只。大鼠BCS模型制备：常规消毒麻醉后，于剑突下正中开腹分离肝镰状韧带，暴露肝后段IVC，平行紧贴IVC以3 F微导管，并以0号线环绕结扎后抽出，逐层缝合关腹（见图1）。假手术组不结扎肝后段IVC，其他过程同模型组。正常组仅常规饲养，不做任何处理，本研究参考同类研究动物实验设计[7-8]，正常组仅观察研究终点12周这个时间点，该组所有时间点相关病理生理数据均用12周的数据进行分析。

图1 模型组结扎IVC

1.2.2 MRI扫描及DSA：MRI扫描：正常组于造模后第12周，模型组及假手术组分别于实验后1、4、8、12周随机取9只大鼠，常规消毒麻醉后，仰卧位腹部加压固定于腕关节线圈中心，以GE HDXT-1.5T磁共振机行常规T1WI、T2WI序列检查及仰卧轴面DWI检查。扫描参数为TR 1 250 ms，TE 65 ms，FOV 55 mm×55 mm，层间距0.2 mm，层厚3.0 mm，反转角90°，激励次数8，矩阵192×192。b值取800 s/mm2，自旋回波-回波平面成像加脂肪抑制。测量各组肝脏ADC值，ROI大小约15～20 mm2，尽量避开胆管、血管及肝脏边缘，分别在肝左、右叶共取2个ROI测得数值的平均值做进一步分析。DSA：各组大鼠于任意一侧下肢消毒、铺巾，以21 G静脉留置针穿刺股静脉，注射对比剂观察IVC血流情况。

1.2.3 HE及免疫组化：正常组于造模后第12周，模型组及假手术组分别于术后1、4、8、12周行MRI检查后，取MRI测量ROI相应层面的新鲜肝组织适量，用10%福尔马林固定24 h，石蜡包埋，制作组织切片，用于HE、免疫组织化学染色。免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡水化，3% H2O2室温孵育5～10 min后PBS冲洗。滴加一抗，室温孵育30～60 min后PBS冲洗。滴加通用型IgG抗体（Fab段）-HRP多聚体，室温孵育10～20 min后PBS冲洗，应用DAB溶液显色，蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，采用已知阳性片作为阳性对照，阳性表达为结构清晰的细胞胞浆棕黄染色。

1.2.4 Real-time PCR：肝组织液氮研磨后加入1 mL TRIzol匀浆，严格按照说明书步骤提取总RNA，提取出的RNA逆转录合成cDNA，行Real-time PCR检测。PCR反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，40个循环。引物序列：β-actin上游序列：5′-CCCATC TATGAGGGTTACGC-3′，下游序列：5′-TTTAATGTC ACGCACGATTTC-3′；HIF-1α上游序列：5′-TGACCA CTGCTAAGGCATCA-3′，下游序列：5′-GGCTCCTT GGATGAGCTTTG-3′；NF-κB上游序列5′-AAGATCT GCCGAGTAAACCG-3′，下游序列：5′-TCCCGTGAA ATACACCTCAA-3′；基因相对表达量以2-△△Ct计算。

1.2.5 Western blotting：肝组织细胞裂解、离心后收集上清液，按照1:4加入5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。沸水浴加热10 min，冷却到室温，上样到SDSPAGE胶加样孔内，每孔5～20 μL。浓缩、分离后300 mA恒流转膜90 min。漂洗5 min，室温封闭2 h。一抗4 ℃孵育过夜，加入洗涤液（PBST），每次10 min，共3次，相应二抗室温孵育2 h。加入PBST洗涤液，每次10 min，共3次。使用ECL试剂盒检测蛋白，以Image J软件分析条带灰度值，相对表达量依照内参照结果计算。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，同一时间点各组ADC值、HIF-1α、NF-κB比较采用单因素方差分析；模型组、假手术组组内各亚组比较采用单因素方差分析；两两比较采用LSD检验。ADC与HIF-1α、NF-κB相关性分析采用以Pearson法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BCS模型大鼠建模情况

正常组存活15只；假手术组术后1、4、8、12周亚组分别存活15、14、15、15只；正常组及假手术组活动如常、反应机警，DSA均无阳性表现。模型组术后1、4、8、12周亚组分别存活14、13、14、13只，活动逐渐减少、反应迟钝，毛色灰暗，存活大鼠均成功建立BCS模型，肝后段IVC管腔变窄，远端扩张，4周后逐渐见侧支循环形成（图2）。

图2 模型组12周DSA图：肝后段IVC管腔闭塞（红箭），远端扩张，见广泛侧支循环形成（黄箭）

2.2 BCS模型大鼠MRI表现

各组大鼠常规MRI T1WI扫描肝实质信号均匀，肝表面光整（图3A～C）。正常组与假手术组ADC值差异无统计学意义（P＞0.05）；正常组ADC值均高于模型组（P＜0.05）；模型组与假手术组ADC值整体差异有统计学意义，随后两两比较，模型组均低于同一时间的假手术亚组（P＜0.05），见表1。

模型组ADC值随时间进展先下降后升高，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）；随后各亚组间两两比较，1周组高于4周组、1周组高于8周组、4周组低于12周组，差异均有统计学意义（P＜0.05），ADC值在4周组最低，见图3D和表1。

2.3 BCS模型大鼠HE及免疫组化结果

正常组及假手术组大鼠观察至第12周，HE染色均无阳性表现，肝细胞规律排列，形态正常，肝血窦未见明显扩张（图4A～B）。模型组大鼠肝脏病理损伤逐渐加重，1周组肝细胞规律排列，形态正常，肝血窦未见扩张（图4C）；4周组肝细胞呈玻璃样变性，肝血窦轻度扩张伴少量红细胞淤积（图4D）；8周组肝细胞玻璃样变性加重，肝血窦扩张伴较多红细胞淤积（图4E）；12周组肝细胞坏死，胞浆红染，肝血窦明显扩张伴大量红细胞淤积（图4F）。

图3 各组大鼠肝脏T1WI图

表1 各组大鼠ADC值（×10-3 mm2/s）比较（各亚组n=9，±s）

表1 各组大鼠ADC值（×10-3 mm2/s）比较（各亚组n=9，±s）

注：与1周组比，*P＜0.05；与4周组比，＃P＜0.05；与8周组比，△P＜0.05；与12周组比，☆P＜0.05；正常组 vs 模型4周组、8周组，均P＜0.05；假手术组 vs 模型4周组、8周组，均P＜0.05。

时间 模型组 假手术组 正常组 F值 P值1周 1.23±0.08#△ 1.26±0.07 1.27±0.08 1.497 0.244 4周 1.03±0.09*☆ 1.28±0.05 1.27±0.08 34.199 0.001 8周 1.12±0.09* 1.28±0.06 1.27±0.08 10.079 0.001 12周 1.18±0.07# 1.27±0.08 1.27±0.08 4.045 0.031 F值 11.184 1.143 — — —P值 0.001 0.934 — — —

正常组（图5A）、假手术组（图5B）观察至第12周，HIF-1α未见阳性染色，模型组第4周HIF-1α（图5C）阳性染色最显著，位于血管内皮细胞、汇管区间质细胞和胶原组织；正常组（图5D）、假手术组（图5E）观察至第12周NF-κB未见阳性染色，模型组第4周NF-κB（图5F）阳性染色最显著，位于血管内皮细胞、汇管区间质细胞和胶原组织。

2.4 BCS模型大鼠HIF-1α检测结果

组间比较，术后1、4、8、12周，同一时间点，三组之间HIF-1α的mRNA及蛋白表达水平均存在统计学差异，两两比较发现正常组与假手术组无统计学差异（P＞0.05），模型组高于假手术组和正常组，差异有统计学差异（P＜0.05）。

图4 术后12周各组大鼠肝脏病理图片（HE，×200）

组内比较，随着梗阻时间延长，模型组HIF-1α的mRNA及蛋白水平先升高后下降，BCS模型造模后4周最高，整体差异有统计学意义（F=877.911、333.136，P＜0.05），两两比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。假手术组内比较无统计学差异。正常组只有一个时间点的数值，不做比较。详见表2和图6。

2.5 BCS模型大鼠NF-κB检测结果

组间比较，术后1、4、8、12周，同一时间点，三组之间NF-κB的mRNA及蛋白表达水平均存在统计学差异，两两比较发现正常组与假手术组无统计学差异（P＞0.05），模型组高于假手术组和正常组，差异有统计学差异（P＜0.05）。

组内比较，随着梗阻时间延长，模型组NF-κB的mRNA及蛋白水平先升高后下降，BCS模型造模后4周最高，整体差异有统计学意义（F=265.148、334.147，P＜0.05），两两比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。假手术组内比较无统计学差异。正常组只有一个时间点的数值，不做比较。详见表3和图6。

2.6 各指标间相关性分析

模型组ADC值与HIF-1α、NF-κB负相关；HIF-1α与NF-κB正相关；详见图7A～C和表4。

3 讨论

BCS随着肝静脉回流受阻后淤血缺氧加重，可造成肝细胞水肿、肝微循环障碍、细胞外基质沉积等，导致细胞内外水分子和灌注的改变，可早于肝脏形态学改变被DWI检测[5-6]。

图5 各组大鼠免疫组化图片（×200）

表2 三组大鼠HIF-1α mRNA及蛋白比较（各组n=9，±s）

表2 三组大鼠HIF-1α mRNA及蛋白比较（各组n=9，±s）

组别1周 4周 8周 12周 F（P）值mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白正常组 1.03±0.11 0.31±0.04 1.03±0.11 0.31±0.04 1.03±0.110.31±0.04 1.03±0.110.31±0.04 - -假手术组 1.05±0.10 0.31±0.03 1.04±0.08 0.30±0.02 1.01±0.090.28±0.04 1.02±0.110.31±0.03 1.022(0.309) 0.714(0.547)模型组 1.70±0.19 0.65±0.04 7.26±0.87 1.28±0.06 4.67±0.241.04±0.07 3.26±0.240.79±0.03 877.911(0.001)333.136(0.001)F值 119.816 253.294 1617.693 1379.092 632.139 1435.154 593.070 1085.194 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

图6 各组HIF-1α、NF-κB蛋白表达图

表3 三组大鼠NF-κB mRNA及蛋白比较（各组n=9，±s）

表3 三组大鼠NF-κB mRNA及蛋白比较（各组n=9，±s）

组别1周 4周 8周 12周 F（P）值mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白正常组 1.02±0.080.33±0.02 1.02±0.08 0.33±0.02 1.02±0.080.33±0.02 1.02±0.080.33±0.02 - -假手术组 1.01±0.09 0.35±0.04 0.99±0.12 0.36±0.08 1.02±0.100.32±0.06 0.98±0.090.34±0.07 0.482(0.697) 0.861(0.471)模型组 1.79±0.18 0.72±0.09 6.87±0.78 1.45±0.09 4.77±0.641.19±0.12 3.57±0.370.88±0.11 265.148(0.001)334.147(0.001)F值 467.294 158.382 548.342 810.293 576.327 682.753 664.178 187.423 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

图7 各指标相关性散点图

表4 ADC值与HIF-1α、NF-κB相关性分析（相关系数r）

HIF-1α是调节参与细胞对缺氧反应的转录因子，在缺氧期间高表达，进而诱导肝脏损伤[9-10]。NF-κB是与免疫球蛋白K轻链基因增强子B位点特异性结合的核蛋白因子，在各种类型的肝损伤及肝纤维化中发挥作用[11]。本研究发现模型组HIF-1α、NF-κB水平均高于正常组及假手术组，且互为正相关，提示其可能相互调节并参与了BCS模型肝损伤的进展。模型组HIF-1α、NF-κB先升后降，不同于其他原因肝病中随肝损伤进展持续上升的报道[10，12-13]，说明其诱导BCS肝损伤的机理有所不同，可能是肝脏淤血缺氧后上调HIF1α表达，激活其下游TGF-β1、PDGF-B等信号转导和上皮间质转化，上调NF-κB，进而诱导肝脏淤血缺氧损伤[12，14]；其后随侧支循环缓解淤血缺氧，从而下调HIF-1α、NF-κB的水平，但其始终高于正常，说明侧支循环仅可部分缓解淤血缺氧，而无法从根本解决BCS淤血性肝损伤[15]。

本研究中，模型组ADC值低于正常组及假手术组，说明BCS肝组织存在水分子弥散受限，模型组的ADC值先下降后上升，与HIF-1α、NF-κB水平先上升后下降形成负相关，不同于其他原因肝病中随肝损伤进展持续下降的报道[16-17]，这可能是因为随着IVC结扎时间延长，肝淤血缺氧加重，引发HIF1α持续高表达及氧自由基增加，激活NF-κB及TGF-β1等信号，导致其下游靶基因的激活和HSC的活化，抑制ECM降解[12-14]；另一方面，HV回流受阻，减弱水分子扩散能力和微循环灌注，肝细胞线粒体肿胀[5]，改变细胞膜的流动性和通透性，降低ADC值[5，18]，故而与HIF-1α、NF-κB负相关，这与病理结果中肝细胞肿胀、肝窦淤血相符，提示ADC值可反映BCS肝淤血缺氧程度。模型组随着侧支循环建立，缓解淤血缺氧及氧化应激，细胞内外水分子扩散及微循环的代偿性改善表现为ADC值升高以及HIF-1α、NF-κB下调[12-14]，这提示三者的变化与淤血缺氧密切相关。然而，ADC值虽有升高，仍低于正常，说明侧支循环虽部分缓解了淤血，但肝脏病理损伤仍缓慢进展，这与大量临床报道相符[15，19]，说明只有介入开通梗阻静脉才是治疗BCS的根本手段。

值得注意的是，本研究还存在局限性：大鼠肝脏体积较小，呼吸运动及肺底和腹腔气体等均可能影响ADC值及病理取材的准确性。大鼠生命周期有限，尚无法完美模拟人体长达数十年的BCS病程。

本研究建立大鼠BCS动物模型，动态检测了ADC值、HIF-1α、NF-κB的变化，发现随着IVC结扎时间延长，BCS肝脏ADC值与HIF-1α、NF-κB负相关，三者随着侧支循环缓解淤血缺氧，改善细胞水肿及微血管灌注而升高（下降），说明这几个指标与BCS的肝淤血缺氧损伤存在一定相关性，可作为无创评估BCS肝损伤的一个新的选择。