微孔板法在一线抗结核药物敏感性试验中的应用价值

杨翰 杨静芬 伍浩 崔晓利 党丽云

结核病是由结核分枝杆菌引起的多器官受损的传染病，主要以肺结核为主。药物化疗是其主要治疗方式，但因近年来耐药结核病的发生率不断上升，使结核病的防治异常严峻。WHO[1]发布的《2019全球结核病报告》指出，2018年全球共有186 772例耐多药及利福平耐药结核病(multidrug- and rifampicin-resistant tuberculosis，MDR/RR-TB)患者，明显高于2017年(160 684例)。因此，药物敏感性试验(简称“药敏试验”)在结核病的治疗中起到了至关重要的作用。目前，临床检测结核病耐药性的主要方法包括分子药敏试验及表型药敏试验，尽管WHO推荐表型药敏试验中的比例法与BACTEC MGIT 960液体培养(简称“MGIT 960” 法)，但由于比例法培养时间长，MGIT 960法检测药物种类较少，使得可大大提升检测药物种类及明显缩短报告时间的微孔板法被广泛应用[2-6]，但其检测结果的可靠性仍需大量临床研究进行验证。本研究以MGIT 960法为标准，分析微孔板法药敏试验对链霉素(Sm)、异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)等4种一线抗结核药物检测的符合率、一致性等指标，为微孔板法药敏试验的临床意义及价值提供参考依据。

材料和方法

一、材料收集

收集2019年1—6月西安市胸科医院收治的经MGIT 960法培养阳性的1086份标本，选择其中经菌种鉴定为结核分枝杆菌且同时对链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇行MGIT 960 法和微孔板法药敏试验的331份菌液，分析两种试验方法的检测情况；并以MGIT 960法为标准，评估微孔板法药敏试验的检测效能，对结果不一致的菌液以熔解曲线法检测耐药基因予以核实。

二、研究方法

1.仪器与试剂：Lad-Aid 824s 核酸提取仪(厦门致善生物科技有限公司)，SLAN系列实时荧光定量PCR检测系统(厦门致善生物科技有限公司)，YK-009 自动加样系统(珠海银科医学工程股份有限公司)，BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养及药敏检测系统(美国BD公司)，结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂盒(链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇，批号 19012101；厦门致善生物科技有限公司)，Lad-Aid 824结核分枝杆菌核酸提取Maxi试剂(批号190111，厦门致善生物科技有限公司；为PCR体系中的引物、dNTP、Mg2+等物质，本研究有MixA、MixB)，MGIT 960 液体药敏试剂盒(批号：804944；美国BD公司)，分枝杆菌药敏检测试剂盒(批号：19011002，珠海银科医学工程股份有限公司)。

2.MGIT 960 法药敏试验的操作方法[7]：(1)菌液准备：取MGIT 960系统报告阳性且菌种鉴定为结核分枝杆菌的菌液，以报告阳性当天记为第0天，若在第1、2天可直接进行工作菌液药敏试验接种，若在第3～5天则需用灭菌生理盐水按照1∶5(1 ml菌悬液、4 ml生理盐水)稀释后的工作菌液进行药敏试验接种。(2)含药培养基准备：于MGIT 960试剂盒取5只培养管，第1管标记GC(空白对照)，其余4管分别标记为Sm(1 μg/ml)、INH(0.1 μg/ml)、RFP(1 μg/ml)、EMB(5 μg/ml)。无菌操作下每管加入0.8 ml增菌剂，在相应含药标记管加入100 μl相应药物干粉，并以4 ml灭菌蒸馏水溶解；空白对照管内加入0.5 ml的1∶100倍稀释的工作菌液(0.1 ml菌液、10 ml灭菌生理盐水)，其余4管含药培养基也加入上述工作菌液0.5 ml，盖紧螺旋盖并混匀。(3)结果报告：将上述培养管放入MGIT 960系统内培养，等待机器报告结果。

3.微孔板法药敏试验的操作方法[8]：备好药敏试验对应菌株和试剂，使用超声分散仪将菌液磨菌比浊至1 mg/ml，取出冻干杂菌抑制剂，将无菌稀释液全部加入后混匀，取出阴性对照管和药敏培养基放置至接近室温，用加样枪分别吸取30 μl抑制剂加入阴性对照管中，吸取100 μl抑制剂加入药敏培养基中，用加样枪吸取菌液100 μl加入药敏培养基后上机，仪器加样完成后取出药敏测试板，盖上盖子，用透明胶带沿周边封1圈后置于37 ℃培养箱中培养，10～21 d内观察结果。微孔板药敏试验中4种药品的耐药浓度分别为链霉素：中敏4 μg/ml，耐药8 μg/ml；异烟肼：耐药2 μg/ml；利福平：中敏 4 μg/ml，耐药8 μg/ml；乙胺丁醇：中敏2.5 μg/ml，耐药5 μg/ml。

4. 熔解曲线法的操作方法：(1)核酸提取：吸取MGIT 960法报告阳性菌液750 μl至1.5 ml EP管中，99 ℃金属浴15 min。按照Lad-Aid 824结核分枝杆菌核酸提取试剂盒说明书进行操作，将获得的DNA溶液以12 000×g离心1 min，收集上清液用于后续试验。(2)试剂配制：取出保存在-20 ℃的相应药物试剂盒平衡至室温，将MixA、MixB涡旋振荡充分混匀，分别吸取19.6 μl MixA、MixB，与0.4 μl酶液(含反转录酶、T7聚合酶)混合后加入0.2 ml离心管中。在相应0.2 ml离心管中加入5 μl 提取的DNA上清液，瞬时离心，弹去气泡，上机检测。(3)结果判读及分析。

三、统计学处理

采用SPSS 18.0软件进行数据的统计学分析。以MGIT 960法为金标准，计算微孔板法对链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇等4种药品的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率及Kappa值，其中Kappa值在0.00～0.20为极低一致性，0.21～0.40为一般一致性，0.41～0.60为中等一致性，0.61～0.80为高度一致性，0.81～1.00为几乎完全一致[9-10]。

结 果

一、微孔板法检测结果

两种方法的检测结果为耐药、中敏及敏感，本结果中的“中敏”纳入“敏感”计算检测效能。以MGIT 960法为标准，对4种药品检测的符合率均在97%以上；除乙胺丁醇的敏感度为66.7%，其他3种药品间的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值均较高。一致性检测中，除乙胺丁醇的Kappa值(0.72)为“高度一致性”外，链霉素、异烟肼、利福平等3种药品的Kappa值(分别为0.93、0.94、0.95)均为“几乎完全一致”。

表1 以MGIT 960法为标准分析微孔板法对4种一线抗结核药品的耐药性检测效能

表2 两种药敏试验不一致结果与熔解曲线结果对比分析

二、微孔板法与MGIT 960法的不同结果分析

微孔板法与MGIT 960法检测4种药品均一致的耐药性结果(包括敏感或耐药)分别为链霉素321份(97.0%)，异烟肼323份(97.6%)，利福平325份(98.2%)，乙胺丁醇315份(95.2%)。两者结果不一致(包含微孔板法的“中敏”结果)主要集中在MGIT 960法为耐药而微孔板法为敏感或中敏(33份)，见表2。经熔解曲线耐药基因分析后结果显示，微孔板法为中敏而MGIT 960法为耐药者10份(3.0%，10/331)，耐药基因均为突变；而微孔板法为中敏而MGIT 960法为敏感仅1份(0.3%，1/331)，且耐药基因为突变；微孔板法为敏感而MGIT 960法为耐药者23份(6.9%，23/331)，耐药基因为链霉素和异烟肼以野生型较多(分别为6/8，4/5)，利福平和乙胺丁醇以突变型较多(分别为3/3，7/7)，具体见表2。

讨 论

目前，结核分枝杆菌表型药敏试验的方法以WHO推荐的比例法及MGIT 960法为主。日常开展实验室工作中，比例法操作较为复杂，单个样本的检测耗时长，操作人员往往对大样本量处理较为困难，且结果报告需要4周；MGIT 960法操作较为简单，结果报告时间短，但对菌液的浊度较难控制，容易造成假阴性结果[8]，且目前仅对一线抗结核药物应用较多。故为了适应临床需求，多种微孔板法药敏检测试剂盒被不断推出，较为成熟的有赛默飞世尔科技有限公司(Thermo Fisher Scientific)、珠海银科医学工程股份有限公司、郑州安图生物工程股份有限公司等生产的试剂盒，本研究仅采用珠海银科医学工程股份有限公司分枝杆菌微孔板法药敏检测试剂盒(培养法)，该试剂盒可检测16种一、二线抗结核药物，其中4种一线药物各4个药物梯度，12种二线药物各2个药物梯度(中敏与耐药MIC浓度)。与MGIT 960法相比，微孔板法是将被检测药物提前包被在96孔板中，由操作人员或自动移液平台将定量的菌悬液接种到96孔板中即可，操作较为简便，而MGIT 960法需要人工配置药物到培养管中，增加了操作程序以及污染风险。

微孔板法作为“十一五”国家科技重大专项的科研转化成果，能够更快速、更简便的检测出4种一线抗结核药物和12种二线抗结核药物的药敏试验结果，有利于早期筛查耐药性。苏碧仪等[11]报道了微孔板法在部分二线抗结核药物中的较高应用价值，与MGIT 960法具有较高的符合度，其检测异烟肼、利福平耐药性的敏感度和特异度与传统的比例法也有较高一致性，且与耐药基因相关检测也有较高符合率。本研究以MGIT 960法为标准对比了微孔板法对一线抗结核药物耐药性检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率、Kappa值等指标，结果显示微孔板法检测4种一线抗结核药物耐药性具有较好的敏感度、特异度，且与MGIT 960法一致率较高，可以满足临床应用，且两种方法不一致结果主要为MGIT 960法为耐药但微孔板法为中敏或敏感，提示微孔板法较MGIT 960法可以检测出低浓度耐药的情况。过去的研究发现，MGIT 960法确定的敏感菌株会存在部分基因突变，表现为这部分患者一线抗结核药物的治疗效果较差，为避免过早放弃使用异烟肼、利福平等核心一线药物，可以利用微孔板法发现低浓度耐药的作用，为临床药物的使用剂量提供参考[12-13]。进一步经熔解曲线法核查耐药基因，发现当微孔板法为“中敏”时耐药基因为突变型；当微孔板法为“敏感”时，链霉素与异烟肼的耐药基因多为野生型，而利福平与乙胺丁醇的耐药基因则全部为突变型。但通过对耐药基因的核查，提示当使用不同表型药敏试验方法检测时，如果出现与耐药基因结果不一致，应进一步复查表型药敏检测为敏感而耐药基因为突变的菌液，以明确表型药敏试验的结果是否可靠。

针对本研究的检测结果，笔者认为可能存在以下不足：(1)本研究采用的试剂盒可报告MIC值，但与抗生素药品的最低抑菌浓度检测法(MIC法)有所区别，在一线抗结核药物中有4个药物梯度，二线抗结核药物仅有中敏与耐药2个药物浓度值且不连续，因此在报告二线药物时仅为参考性最终结论，不能以报告的MIC值判断药物的抑菌浓度。(2)微孔板法操作需要严格无菌操作，若出现单孔污染时应当分析是否影响整体试验结果，特别是在二线药物仅有2个药物梯度的前提下，随机的单孔污染都应当进行复检来保证结果的可靠性。(3)本研究采用的试剂盒配备的药敏判读软件，在正常输入结果后，仪器判读的MIC值为细菌生长的药物浓度最高孔，而非最低抑菌浓度孔，实验室操作人员应注意判读标准，以避免发布错误报告，影响患者治疗。(4)在检测过程中，出现部分96孔板孔序倒置的问题，例如：原A、B列的阳性对照孔出现在K、L列(该药敏板在生产时存在孔序倒置问题)，表明此次试验失败，需重新进行药敏试验。

综上所述，微孔板法药敏试验对一线抗结核药物的检测与MGIT 960法具有较高的一致性，可基本满足临床需求，但实验室操作人员需严格把控检测试剂盒的质量以及结果审核，避免出现错误报告。