热带睡莲精油的超临界CO2萃取优化及其成分GC-MS分析

黄秋伟，毛立彦，龙凌云，唐毓玮

（广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西南宁530001）

植物精油，又称植物芳香油，指的是一类相对分子量较小的植物次生代谢产物，通常蕴含于植物体的香气部位，本身具有浓郁、鲜明的香气特征和挥发性。国际标准化组织定义植物精油是存在于植物体的一类可随水蒸气蒸馏得到，且具有一定香味的挥发物油状液体。精油按其来源可分为八大类，其中花香类精油算是来源比较广泛的一类[1]。目前植物精油的主要提取手段有水蒸气蒸馏、吸附法、溶剂浸提、超临界流体萃取、亚临界流体萃取等这几种，常用的水蒸气蒸馏和溶剂浸提在提取时往往会引起部分精油组分的改变，造成芳香味流失或者改变，同时会有溶剂残留的风险。而超临界流体萃取采用的流体（如CO2）通常是无害的，且在超临界状态下流体对挥发性溶质的溶解度增加显著，流体与溶质分离方便，无溶剂残留。因此采用超临界流体萃取植物精油是一种比较环保且提取效率较高技术手段，当前关于应用超临界流体技术萃取植物油脂方面的研究报道日趋增多[2-6]。植物精油主要是一些挥发性成分，而关于挥发性成分的分析技术应用较为成熟的是气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），且相关报道较多[7-14]。

睡莲是世界名花之一，为睡莲科睡莲属多年生宿根草本类植物，广泛分布于热带和温带地区。该属植物按其生态学特征可分为热带睡莲和耐寒睡莲两大类，其中，大多数热带睡莲的品种及栽培种的鲜花色彩鲜艳、芳香气味独特且清雅宜人，而其它植物部位不具备芳香气味。芳香气味一般均来自植物精油中的挥发性有机物，目前，关于睡莲的研究主要集中于基因组及形态多样性分析[15-16]、睡莲花色组成[17]、睡莲生理机制[18-19]、品种栽培与选育[20]、睡莲对水环境的金属离子吸收机制[21]等方向，但在睡莲精油的提取研究报道极少，而关于应用超临界流体技术萃取热带睡莲精油的研究暂未见报道，因此开展热带睡莲精油超临界萃取工艺研究具有一定的意义。本文选用热带睡莲的代表品种“保罗兰”作为研究对象，采用超临界CO2萃取法来提取热带睡莲精油，同时通过单因素及正交试验来优化提取工艺，并利用GC-MS检测手段检测分析超临界CO2萃取得到的睡莲精油挥发性组分，为热带睡莲精油今后在食品、医药及化妆领域的综合开发利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

热带睡莲鲜花：广西亚热带作物研究所提供的“保罗兰”品种；CO2气体（食品级，纯度≥99.9%）：广西国信气体研究院有限公司；无水乙醇（2.5 L装分析纯）：成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

HA221-40型超临界流体萃取装置：江苏南通华安超临界萃取有限公司；7980A/5975C气相色谱-质谱联用仪：美国 Agilent公司；50/30μm CAR/PDMS/DVB萃取纤维头：美国SUPELCO公司；MJ33型快速水分测定仪：梅特勒-托利多公司；GR200型电子分析天平：日本A&D公司。

1.3 方法

1.3.1 超临界CO2萃取材料的筛选

1.3.1.1 鲜花采摘时间的筛选

睡莲花一般连续开花4 d～5 d就会出现凋谢迹象，同时伴随开花时间的延长，鲜花体内的次生代谢物含量也会发生变化，因此，鲜花材料的采摘时间选择对精油得率的高低有一定的影响。本次试验选用开花前3 d的鲜花作为考察对象，并通过水蒸气蒸馏进行预试验筛选出适合的鲜花采摘时间。依据《中华人民共和国药典》2010版Ⅰ部附录XD挥发油测定法的甲法操作步骤进行水蒸气蒸馏提取精油试验。按睡莲花开花1 d、开花2 d、开花3 d的开花时间顺序分成3组，并将其鲜花作为提取原料来采摘，每组鲜花原料各称取50 g，固定料液比 1∶10（g/mL）及回流提取时间 5 h两个提取条件进行水蒸气蒸馏。提取结束后，利用微量注射器吸取收集器内的油相成分，转移至离心管中并进行称重，之后置于-20℃条件下冷冻保藏备用，按下式计算精油得率，比较不同开花时间对精油得率的影响，以此来筛选出鲜样的精油出油量最高的睡莲鲜花材料采摘时间。

式中：m表示收集器的油相质量，g；M表示提取的鲜样质量，g。

1.3.1.2 不同花器官材料的筛选

为保持鲜花精油活性，本次超临界萃取试验样品不进行物理干燥及粉碎预处理，采用鲜样形式进行萃取，而鲜样含水量太高的话，则会影响精油的超临界萃取效率。本次试验选用鲜花整花以及不同的花部位作为研究对象，并通过水蒸气蒸馏进行预试验筛选出精油富集的花部位，以此为材料来减轻水分对萃取效率的影响。依据1.3.1.1步骤所得的试验结果，将其筛选出来的鲜花材料作为试验材料。固定料液比1∶10（g/mL）及回流提取时间5 h两个提取条件，以鲜花整花提取作为对比，分别选取睡莲鲜花的子房、雄蕊、花瓣这三部分作为提取材料，整花材料称重50 g，而后面三者的称重方式则是以所称取的整花重量为基准，按三者在整花中的重量占比来进行换算称重。在整花重量中，三者重量占比依次为：子房重量55%＞雄蕊重量35%＞花瓣重量10%。各个部分称重完毕后按操作进行水蒸气蒸馏提取。提取结束后，利用微量注射器吸取收集器内的油相成分，转移至离心管中并进行称重，之后置于-20℃条件下冷冻保藏备用，计算精油得率，比较整花与不同花器官对精油得率的影响，以此来筛选出油量最高的鲜花部位。

1.3.2 超临界CO2萃取精油的单因素和正交试验

超临界CO2萃取过程中的影响因素较多，本次优化试验先选用超临界CO2萃取提取过程中萃取压力、温度及时间3个主要影响因素进行研究，考察精油得率随这3个主因的改变而表现出来的变化规律。主要操作流程如下：称取1.3.1步骤筛选出来的鲜花材料50 g，取1 L装料罐进行装料，并放入萃取釜中密封关闭。控制CO2流速30 L/h左右，在分离釜Ⅰ压力6.0 MPa、分离釜Ⅰ温度30℃、分离釜Ⅱ压力5.8 MPa、分离釜Ⅱ温度25℃这一分离条件下，设置萃取压力及萃取温度，当萃取釜的压力及温度达到相应的设置条件时，开始计时并维持该萃取条件进行动态循环萃取，当萃取时间达到设定的时间后，停止萃取，从分离釜下方的出料口中接取分离得到的物料，利用微量注射器从分离得到的物料中吸取漂浮于水相上面的黄色油层，转移至离心管中，进行称重，之后置于-20℃条件下冷冻保藏备用，并按照下式计算精油得率。

式中：m1表示分离釜Ⅰ出口油相质量，g；m2表示分离釜Ⅰ出口油相质量，g；m表示萃取鲜样质量，g。

1.3.2.1 萃取压力对得率的影响

称取50 g的睡莲鲜样5份，分别将萃取压力设置成 20、22.5、25、27.5、30 MPa这 5 个水平，在固定萃取温度40℃、动态循环萃取时间90 min的条件下进行精油萃取，萃取结束后从分离釜中接取物料，利用微量注射器吸取黄色油层，转移至离心管中，进行称重并计算得率，比较不同萃取压力对睡莲精油提取率的影响。

1.3.2.2 萃取温度对得率的影响

称取50 g的睡莲鲜样5份，分别将萃取温度设置成 30、35、40、45、50 ℃这 5 个水平，在固定萃取压力20 MPa、动态循环萃取时间90 min的条件下进行精油萃取，萃取结束后从分离釜中接取物料，利用微量注射器吸取黄色油层，转移至离心管中，进行称重并计算得率，比较不同萃取温度对睡莲精油提取率的影响。

1.3.2.3 萃取时间对得率的影响

称取50 g的睡莲鲜样5份，分别将萃取时间设置30、60、90、120、150 min 这 5 个水平，在固定萃取压力20 MPa、萃取温度40℃的条件下进行精油萃取，萃取结束后从分离釜中接取物料，利用微量注射器吸取黄色油层，转移至离心管中，进行称重并计算得率，比较不同萃取压力对睡莲精油提取率的影响。

1.3.2.4 超临界CO2萃取精油的正交试验

根据单因素试验结果，将萃取压力、萃取温度、萃取时间选为试验因素，每个因素个设置水平3个，采用四因素三水平的正交表进行正交试验设计，具体因素及水平设置见表1。本次正交试验以睡莲花精油得率作为提取优劣的评价指标，并以此来对超临界CO2萃取睡莲花精油的工艺条件进行优化。

表1 正交试验设计表Table 1 Orthogonal array design table

1.3.3 挥发性成分分析

1.3.3.1 上样前的样品处理及进样

取0.5 g超临界萃取油相样品置于20 mL顶空瓶中，拧紧瓶盖。于60℃的温度条件下平衡5 min，然后用固相微萃取针于60℃下萃取25 min，最后于进样口解吸5 min。

1.3.3.2 仪器分析条件

色谱条件：色谱柱为HP-INNOWAX毛细管柱子（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为 He，流速 1 mL/min，分离比5∶1；进样温度为250℃；升温程序为起始温度为40℃，保持5 min，以8℃/min，升至250℃，保持5 min。质谱条件：EI电离子源，能量70 eV；离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接口温度250℃，扫描范围30～400 m/z。

1.4 数据分析

本次研究中的单因素及正交试验数据均采用SPSS19.0统计软件进行显著性分析和方差分析。成分数据定性分析是通过NIST08谱图库检索法结合人工谱图分析法来分析；定量分析则是按照峰面积归一化法来进行计算，从而分析相对含量。

2 结果与分析

2.1 超临界萃取材料的筛选结果

2.1.1 开花时间对精油出油率的影响

不同开花时间的鲜花采摘对精油出油率的影响结果见图1。

图1 开花时间对精油得率的影响Fig.1 Effect of flowering times on the yield of essential oil

如图1所示，随着开花时间的延长，睡莲精油得率呈现出下降的趋势，且均表现出了显著性差异。在同样的提取条件下，开花2 d的精油得率只有0.152%，相较于开花1 d的精油得率0.176%下降了13%，下降幅度较大。开花3 d的精油得率下降则更为明显，只有0.109%，相较于开花2 d的得率下降了28%。因此，为了获得较高的精油得率，本次超临界萃取试验决定摘取开花1 d的睡莲鲜花作为后续的筛选材料。

2.1.2 花器官取材对精油出油率的影响

不同鲜花部位对精油出油率的影响结果见图2。

图2 不同花部位对精油得率的影响Fig.2 Effect of different part from flower on the yield of essential oil

如图2所示，同样的提取条件，不同花部位的精油得率均各不相同，其中，子房和花瓣两者的精油得率分别为0.026%、0.032%，花瓣得率略高于子房，但两者不显著。雄蕊的精油得率约为0.178%，与子房和花瓣两者的得率相比要高得多，且差异显著，而相对于整花的提取效果，整花的精油得率约为0.171%，雄蕊精油的得率稍微高一些，但无显著性差异。出现上述变化现象，是由于在大多数热带睡莲品种中，鲜花中雄蕊挥发性物质含量几乎在70%～90%之间，与整体鲜花的挥发物含量无显著差异。而花瓣与子房的挥发性物质含量较低，且子房的挥发物不具备芳香。由此可以认为睡莲雄蕊的挥发性物质含量能够代表整朵鲜花的含量。而鲜花含水量经测定一般都在92%左右，含水量太高，不利于超临界萃取。因此，综合含水量和精油含量这两方面来考虑，本次超临界萃取试验决定采用雄蕊作为鲜样材料。

2.2 超临界CO2萃取精油的单因素试验结果

2.2.1 萃取压力对精油得率的影响

在固定萃取温度40℃、动态循环萃取时间90 min的条件下，设置不同萃取压力水平对鲜样精油得率的影响结果见图3。

图3 萃取压力对精油得率的影响Fig.3 Effect of extraction pressure on the yield of essential oil

由图3可知，睡莲精油得率随着压力的升高呈现出不规则的变化，当压力从20 MPa往22.5 MPa升高时，精油得率显著下降，下降幅度约为46%。当压力从22.5 MPa往27.5 MPa区间升压时，精油得率表现出升高的态势，且差异显著，27.5 MPa时得率达到最高，约为1.42%。当压力升高至30 MPa，精油得率又显著降低，下降至1.19%。压力从20 MPa往22.5 MPa升高，精油得率下降的原因可能是由于含水量较多的鲜样，在升高压力时，细胞质内的水分受压力挤压加速渗出，从而在物料的表面形成一层水膜，既不利于溶质的溶出，也不利于CO2的进入，增加了传质阻力，而此时的压力条件又不足以破除这种水膜阻断作用，使得萃取率显著下降[22]。当压力为30 MPa时，此时高压条件下的CO2流体密度增加降低，精油分子溶出减弱而导致得率下降。因此，本次正交试验选取25、27.5、30 MPa作为试验水平。

2.2.2 萃取温度对精油得率的影响

在固定萃取压力20MPa、动态循环萃取时间90min的条件下，设置不同萃取温度水平对鲜样精油得率的影响结果见图4。

如图4所示，睡莲精油得率随着萃取温度的提高表现出规律性变化，当萃取温度在30℃～45℃这一段升温区间时，随着温度的提高，各个温度梯度的精油得率表现出了显著升高的规律性变化，而当温度达到45℃时，精油得率达到最高，约为1.35%。当温度进一步提高至50℃时，精油得率出现显著下降，降至0.88%。这是由于温度升高，热效应增强，精油分子加速随流体溶出，当温度过高时，精油中的一些热敏成分出现损失而导致得率降低。因此，本次正交试验选取40、45、50℃这3个梯度作为试验水平。

图4 萃取温度对精油得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of essential oil

2.2.3 萃取时间对精油得率的影响

在固定萃取压力20 MPa、萃取温度40℃的条件下，设置不同动态循环萃取时间水平对鲜样精油得率的影响结果见图5。

图5 萃取时间对精油得率的影响Fig.5 Effect of extraction time on the yield of essential oil

如图5所示，睡莲精油得率随着萃取时间的延长表现出规律性变化。当萃取时间从30 min～90 min这一区间逐步延长时，各个时间梯度的精油得率呈现出了逐渐升高的态势，且均有显著性差异。当时间从90 min延长至120 min时，精油得率出现升高，但差异性不显著，此时精油得率最高，约为1.10%。当时间进一步延长至150 min时，精油得率出现下降，但与90、120 min两个梯度相比，但无显著差异。这是由于随着时间延长，精油分子与CO2流体接触越充分，溶出越多，从而得率不断提高，当时间延长至90 min时，溶出效果慢慢达到饱和，时间再往后延长，萃取效率处于一种略微浮动的平衡状态。因此，本次正交试验选取90、120、150 min这3个梯度作为试验水平。

2.3 超临界CO2萃取精油的正交试验结果

以睡莲花精油得率作为提取优劣的评价指标，超临界CO2萃取睡莲花精油的正交试验结果如表2所示。试验结果的方差分析见表3。

表2 正交试验及结果Table 2 Orthogonal test and result

表3 方差分析结果Table 3 Analysis result of variance about orthogonal test

由表2的极差R值计算结果可以看出，所选取的试验因素对于睡莲精油得率的影响顺序依次为：萃取压力＞萃取温度＞超声时间，将空列D排除，选择萃取压力、萃取温度、萃取时间3个因素的正交试验数据做后续的方差分析。从方差分析结果中可以看出，正交试验中的萃取压力及萃取温度对睡莲精油得率的影响有显著性差异（P＜0.05），萃取时间对精油得率的影响无显著差异，这与单因素试验中所选取的各个因素试验水平所表现出来的差异性结果相一致。此外，从正交试验的数据计算结果，可以很明显的看出，理论上的最佳睡莲精油萃取工艺条件为A2B2C2。依据这一理论条件来做验证性试验，并平行重复3次，睡莲精油得率分别为1.96%、1.87%、1.92%，重复的均值为1.91%，平行试验的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值为2.35%，因此，可以认为通过正交优化试验得到的理论工艺条件具备重复操作性。由此可以得出，超临界CO2萃取睡莲精油的最佳工艺参数为：萃取压力27.5 MPa、萃取温度45℃、萃取时间120 min。

2.4 挥发性成分GC-MS分析结果

超临界萃取睡莲油样品经顶空固相微萃取，并利用GC-MS检测技术对其内含组分进行分析，其挥发性成分及相对含量如图6和表4所示。

图6 热带睡莲精油的总离子流图Fig.6 Total ion chromatogram of essential oil in tropical water lily

如图6所示，超临界萃取的精油样品经顶空固相微萃取后，通过GC-MS技术检测，在31 min内得到了该精油的总离子流图，在图中总共出现了54个离子峰，表明共检测出了54种化合物，并通过分析在表4中分别列出了这54种化合物的名称及其相对含量。其中，在这54种化合物中出现了乙醇和11种苯类物质，但相对含量均偏低。出现这情况可能是由外界引入的一些干扰物质导致检出的，因在每次超临界萃取操作前都会用无水乙醇对仪器进行清洗后，再开始新物质的提取，因此可能是由于附着于仪器管路的残留无水乙醇与精油混合而导致乙醇分子的检出。本次试验贮存睡莲精油所用的离心管是由苯类化合物聚合而成的树脂聚合物，而精油对各种蜡、树脂类、脂肪以及树胶类等物质具备一定的溶解能力，因此可能是在保存的过程中离心管中的苯类物质微量溶于精油中，才导致苯类化合物的检出。

表4 睡莲精油各组分的检测结果Table 4 Analysis result of essential oil in tropical water lily

续表4 睡莲精油各组分的检测结果Continue table 4 Analysis result of essential oil in tropical water lily

排除上述的12种干扰物质后，本次研究中的超临界萃取的睡莲精油样品可检测出的挥发类化合物有42种。从表4中可以看出，烷烃类和烯烃类化合物在种类及含量均占有优势，其次依次是醇类、醛类和酮类化合物，由此可以看出烃类、醇类、醛类和酮类化合物是睡莲精油芳香成分的主效物质。其中烷烃类化合物有12种，相对含量为46.371%；烯烃类化合物有11种，相对含量为49.513%；醇类化合物有5种，相对含量为14.864%；醛类化合物有5种，相对含量为2.508%；酮类化合物有4种，相对含量为2.027%。此外，在这些化合物中，相对含量超过5%的有5种，含量最多的成分是6，9-十七碳二烯（含量为25.406%），其次依次是十五烷（含量为22.010%）、苄基醇（含量为11.011%）、8-十七碳烯（含量为9.916%）和金合欢烯（含量为8.601%）。上述优势成分及相对含量的排序分析结果与袁茹玉[23]利用固相微萃取技术，萃取22个热带睡莲栽培品种鲜花整花的挥发性物质GC-MS分析结果相一致。

3 结论

本次研究首次采取超临界CO2萃取热带睡莲精油，并对其萃取工艺参数进行优化试验。先以不同开花时间的鲜花和不同鲜花部位作为研究对象进行预试验，并以水蒸气蒸馏法来提取精油，比较精油得率来进行超临界萃取原材料的筛选。预实验结果表明，睡莲鲜花开花时间越长，精油得率越低，开花一天的精油得率最高；在不同的花部位中，睡莲雄蕊的精油得率最高，且与鲜花整花相比无显著差异，因此将开花一天的睡莲鲜花雄蕊作为超临界萃取工艺优化试验的材料。经单因素和正交试验优化工艺，试验表明，超临界CO2萃取睡莲精油的最佳工艺参数为萃取压力27.5 MPa、萃取温度45℃、萃取时间120 min，在此条件下的睡莲精油得率约为1.91%，与筛选试验中的热带睡莲雄蕊水蒸气蒸馏精油得率0.176%相比，得率显著提高。萃取所得的精油经GC-MS检测分析，排除一些外界引入的干扰物后，共分离出42种挥发性成分，其中优势成分分别是6，9-十七碳二烯（含量为25.406%）、十五烷（含量为22.010%）、苄基醇（含量为11.011%）、8-十七碳烯（含量为9.916%）和金合欢烯（含量为8.601%）这5种。本次试验结果可为热带睡莲精油今后食品、医药及化妆领域进一步的开发利用提供科学理论依据。