中蜂与意蜂荔枝蜜挥发性成分的测定与对比分析

王桃红，崔宗岩，张少博，贾光群，魏红跃，李学民，张进杰，魏玉海，王向红

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定071000；2.秦皇岛海关技术中心，河北秦皇岛066004；3.西宁海关技术中心，青海西宁810001）

荔枝蜜是以荔枝为蜜源植物酿造而成的，多产自我国华南地区[1]，如广东、广西、福建等省份。荔枝蜜呈淡琥珀色，质地浓稠，微酸，有微结晶现象，具有荔枝清香气味[2-3]。荔枝蜜因蜂种的不同可分为中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜。蜂蜜的香气主要与其挥发性组分有关[4-6]，主要类别是萜烯及其衍生物和苯的衍生物[5，7-9]等。已有研究对我国洋槐蜜[10-15]、油菜蜜[10，12，14，16-19]、荆条蜜[10-11，13]、枣花蜜[11，13，20-21]、椴树蜜[10-12，14]等主要蜜种挥发性成分进行了报道。然而，国内外对荔枝蜜挥发性成分的报道较少，龙银花等[22]采用循环气提-树脂吸附法采集荔枝蜜的香气物质，共鉴定出14种化合物；Praetinee Pattamayutanon等[5]利用顶空固相微萃取气质联用（headspace solid phase microextraction，HS-SPMEGC-MS）技术分析泰国荔枝蜜中的挥发性有机化合物，共检测出30种挥发性物质，其中芳樟醇氧化物为含量最高的成分。

本文研究采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC/MS）分别对我国不同产地采集的18批荔枝蜜的挥发性成分进行检测，对荔枝蜜的挥发性成分组成、不同蜂种荔枝蜜挥发性成分的差异进行系统分析和评价，可有效区分中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜。

1 试验材料与方法

1.1 蜂蜜样品

研究所用蜂蜜样品均是在荔枝植物的开花流蜜季节（2018年3月～5月）采自中国华南地区。所有样品直接从蜂农手中获得，检测前一直置于4℃条件下保存。其中中蜂荔枝蜜7份，意蜂荔枝蜜11份，验证样品中蜂和意蜂荔枝蜜各5份，详细信息见表1。

表1 荔枝蜜样品采集信息表Table 1 Information of collected honey samples

续表1 荔枝蜜样品采集信息表Continue table 1 Information of collected honey samples

1.2 仪器设备

7890B-5977B型气相色谱-质谱联用仪（配置分流/不分流进样口和固相微萃取专用衬管）、Agilent DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国 Agilent公司；MPS多功能样品前处理平台（配置自动化顶空固相微萃取手柄）：德国Gerstel公司。

1.3 试剂与材料

固相微萃取纤维：50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）、85 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 和 65 μm PDMS/DVB 4 种不同涂层的纤维头：美国Sigma-Aldrich Supelco公司；20 mL顶空瓶：德国Gerstel公司；配置硅胶/聚四氟乙烯隔垫、20 mm铁盖、压盖器、启盖器：德国CNW科技公司。

1.4 试验方法

1.4.1 样品处理和SPME条件

准确称取（2.0±0.1）g蜂蜜样品于20 mL顶空瓶中，加盖密封后直接置于样品前处理平台上进行固相微萃取。

SPME条件：萃取纤维为50/30 μm DVB/CAR/PDMS；萃取温度：60 ℃；平衡时间：20 min；震荡速率：250 r/min；萃取时间：45 min；进样口解析时间：5 min。

1.4.2 GC-MS条件

GC条件：进样口温度270℃，载气为高纯氦，流量1.0 mL/min，不分流进样；升温程序：初始温度40℃，保持3 min，然后以3℃/min速率升至160℃，然后以10℃/min速率升至270℃，保持6 min。

MS条件：电子轰击离子源（electron ionization，EI）70 eV；传输线温度270℃；离子源温度230℃；全扫描模式，扫描范围为25～450 m/z。

1.4.3 定性定量方法

主要采用3种方法对目标化合物进行定性

1）将目标色谱峰对应质谱图扣除背景空白后，进行NIST14谱库检索，正相和反相匹配度均在800以上，且相似度得分值最高的化合物，即认定为目标物，由柱流失带来的硅氧烷类化合物不计在内；

2）对相似度得分接近而保留指数（retention index，RI）有明显差异的化合物，通过参考其RI值进行定性；

3）部分同分异构体质谱图相似，RI值差别也较小，则通过标准品进行保留时间验证，最终确定柠檬烯保留时间（retention time，RT）（RT：15.90）、丁香醛 A（RT：21.52）、丁香醛 B（RT：21.92）、丁香醛 D（RT：22.59）和萜品烯-4-醇（RT：23.37）。

采用面积归一化法测定样品中挥发性成分的相对含量，对GC-MS总离子流色谱图中目标峰进行积分和计算峰面积，每个目标峰的面积与总峰面积之比，即为该目标物的相对含量。除柱流失带来的色谱峰之外，由样品储存介质带来的增塑剂类（如邻苯二甲酸酯等）色谱峰，也不计在目标峰内。

2 结果与讨论

2.1 SPME参数选择和优化

2.1.1 萃取纤维纤维的选择

萃取纤维的选择决定了萃取目标物的种类和数量。本研究考察了最常用的50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 和 65 μm PDMS/DVB 4种不同涂层的纤维对某代表性荔枝蜜挥发性成分的萃取效果。结果表明，DVB/CAR/PDMS、PDMS/DVB纤维萃取的数量分别为92、86种，CAR/PDMS、PDMS、PDMS/DVB 分别为60、71种。DVB/CAR/PDMS和PDMS/DVB纤维对蜂蜜挥发性成分萃取的数量要明显多于另外两种纤维，与Pearez R A[23]和Ceballos L[24]等报道一致。由于DVB/CAR/PDMS较PDMS/DVB纤维吸附挥发性成分的极性范围更广，在蜂蜜中挥发性成分的研究中应用更为广泛[10，14，18，21]，因而本研究选用50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维。

2.1.2 萃取温度的选择

试验考察 30、40、50、60、70 ℃的温度下样品中挥发性成分的萃取效果。结果表明，在不超过60℃条件下，随着萃取温度的升高，目标峰的总峰面积从1.24×109增加到1.45×109，响应值逐渐增高，60℃和70℃条件下大多数目标峰响应值变化不大，分别为1.45×109、1.42×109。由于温度过高会使蜂蜜中部分挥发性成分发生变化，当超过70℃条件下羟甲基糠醛含量会升高[25]，而一般认为60℃以下蜂蜜的主要成分不发生明显变化，因而选择60℃为萃取温度。

2.1.3 萃取时间的选择

考察萃取时间为 10、20、30、45、60、90 min 条件下样品中挥发性成分的萃取效果。结果表明，在不超过45 min条件下，随萃取时间的延长，总峰面积从6.97×108到1.41×109，大部分挥发性成分的响应值逐渐增强，但当萃取时间再增加至60 min或90 min时，目标物响应值变化不大，分别为 1.39×109、1.40×109。为保证目标物具有较高的响应值同时节约分析时间，选取45 min为萃取时间。

2.2 荔枝蜜的挥发性成分

中蜂和意蜂荔枝蜜样品的总离子流色谱图见图1。

在优化的试验条件下，荔枝蜜中挥发性成分均得到良好的分离，18批荔枝蜜中共检测出98种挥发性成分，中蜂和意蜂荔枝蜜中挥发性成分的相对含量见表2。

图1 中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜挥发性成分总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

表2 中蜂和意蜂荔枝蜜中挥发性成分的相对含量Table 2 Amount of volatile compounds in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

续表2 中蜂和意蜂荔枝蜜中挥发性成分的相对含量Continue table 2 Amount of volatile compounds in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

续表2 中蜂和意蜂荔枝蜜中挥发性成分的相对含量Continue table 2 Amount of volatile compounds in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

由表2可知，中蜂荔枝蜜检出93种，意蜂荔枝蜜检出85种。荔枝蜜挥发性成分主要包括醇类、芳香族类、醛类、酸类、萜烯类、酮类、烷烃类、酯类等，另有15个目标峰未鉴定具体化合物种类（标记为未知峰）。

中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜挥发性成分种类比对如图2所示。

由图2可知，中蜂荔枝蜜的挥发性成分主要由萜烯类、醇类、醛类、酮类组成，这4类挥发性成分的含量占挥发性成分的86.29%。意蜂荔枝蜜的挥发性成分主要由萜烯类、醛类、酮类和芳香类组成，这4类挥发性成分的含量占挥发性成分的86.62%。中蜂和意蜂荔枝蜜中萜烯类物质相对含量均最高，分别占挥发性成分的64.65%和64.28%。醇类化合物在中蜂荔枝蜜中含量相对较高，占到挥发性成分的7.86%，而意蜂荔枝蜜中醛类化合物含量相对比较高，占挥发性成分的12.27%。

图2 中蜂和意蜂荔枝蜜中挥发性成分的种类及相对含量Fig.2 Volatile compounds types and amount of lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

所有样品中含量最高的挥发性成分均为芳樟醇氧化物，中蜂荔枝蜜中平均含量占到51.40%，意蜂荔枝蜜中占37.56%，该结果与泰国荔枝蜜一致[5]。

2.3 中蜂和意蜂荔枝蜜挥发性成分对此分析

文献报道不同蜂种的蜜蜂会对同一种蜜源植物的挥发性成分产生一定影响[5，26]。本研究进一步详细对比了中蜂和意蜂荔枝蜜挥发性成分的异同，由表2数据可知，中蜂和意蜂荔枝蜜挥发性成分中共有成分为80种，占总挥发性成分的81.63%，说明不同蜂种荔枝蜜挥发性成分整体上相似，但二者也都存在各自的差异性成分。对比研究发现，庚醇、乙酸苯乙酯、正壬醇、丁香醇等化合物只在中蜂酿造的荔枝蜜中检出，在意蜂荔枝蜜中未发现，且具有显著性差异。而在意蜂酿造的荔枝蜂蜜样品中，癸醛、环氧芳樟醇氧化物和某未知峰（RT：27.98）均检出，中蜂荔枝蜜样品中则均未出现，且具有显著性差异。差异挥发性成分的含量见图3，通过其异同可以有效区分中蜂和意蜂荔枝蜜，为不同蜂种酿造的荔枝蜜的鉴别提供了新的技术手段。

通过方差分析，进一步对结果进行验证，试验结果见表3。

由表可见，正庚醇、正壬醛、丁香醇、乙酸苯甲酯、癸醛、环氧芳樟醇氧化物和未知峰（RT：27.98）在中蜂和意蜂荔枝蜜中存在明显差异，分别为中蜂和意蜂的差异性成分，可以对中蜂和意蜂进行区分鉴别。试验结果可靠。

图3 中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜中差异挥发性成分Fig.3 Different volatile compounds of lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

表3 中蜂和意蜂荔枝蜜中差异挥发性成分相对含量Table 3 Amount of different volatile compounds in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

3 结论

采用顶空固相微萃取（HS-SPME）-气质联用（GC-MS）技术对我国不同产地采集的18批荔枝蜜的挥发性成分进行检测，共检测出98种挥发性成分，其中含量最多的均为萜烯类物质。正庚醇、正壬醇、乙酸苯乙酯、丁香醇仅在中蜂荔枝蜜被检出，而癸醛、环氧芳樟醇氧化物和某未知色谱峰（RT：27.98）仅在意蜂荔枝蜜中被检出。通过差异挥发性成分可以有效区分中蜂和意蜂荔枝蜜，为不同蜂种酿造的荔枝蜜的鉴别提供了新的技术手段。