壳聚糖-咖啡酸衍生物涂膜对多宝鱼保鲜效果的研究

唐森，何剑，张义浩，张鹏，吴国勇，*

（1.广西科技师范学院食品与生化工程学院，广西来宾546119；2.广西科技师范学院功能性食品配料工程技术研究中心，广西来宾546119）

多宝鱼原生长地为欧洲的大西洋区域，通常被称 作“欧洲比目鱼”，多宝鱼味道香鲜甜美、口感软嫩爽滑、富含胶质蛋白还可以助阳提神、补肾健脑；经常食用不仅可以滋补身体，还可以提高人体的抗病毒能力[1]。但由于其生长环境的不同以及微生物的影响，其在运输以及加工的过程中易发生变质和腐败[2]。因此需要寻求一种无污染、高安全、高效的保鲜手段，来抑制多宝鱼在运输加工过程中的腐败变质，维持其新鲜程度以及风味，使多宝鱼的货架期得到更好的延长，提高其经济价值。

壳聚糖（chitosan）是自然界中广泛存在的一种大分子物质。由于其具有良好的成膜性和广谱抑菌性且天然无毒易降解、可再生等特点被广泛应用于食品保鲜工程、制药、纺织、农业、污水处理和化妆品等众领域[3-9]。但由于壳聚糖分子间存在着强氢键，不易溶于水，因此，对壳聚糖进行改性，增加其抗氧化能力及其抗菌能力并赋予壳聚糖新的特性是壳聚糖研究领域的一大热点。

咖啡酸（caffeic acid）是自然界中一种天然存在的酚酸，其固体使一种黄色的晶状物，其具有抗氧化、调节免疫和抗氧化等多种生物活性[10-14]，在过去的研究中，已有部分研究人员通过接枝反应构建以咖啡酸等酚酸与壳聚糖反应生成复合材料，期望提高壳聚糖的溶解性能以及抗菌性能[15-16]。

本文通过接枝反应在壳聚糖中引入咖啡酸，形成具有杀菌抑菌活性的壳聚糖-咖啡酸衍生物，并研究衍生物对多宝鱼冷藏保鲜期间（4℃）挥发性盐基氮、菌落总数、pH值、持水力以及感官评价变化，探索其延长鱼肉货架期的保鲜机理，为制备以生物大分子为基质的涂膜材料提供一定的理论依据，为多宝鱼等水产品的冷藏保鲜提供一种新的解决方案。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多宝鱼：来宾市兴宾区大洋百货商场，约500 g一尾；壳聚糖：山东西亚化学股份有限公司；咖啡酸：武汉长成化成科技发展有限公司；平板计数琼脂：上海博微生物科技有限公司；抗坏血酸、30%过氧化氢（H2O2）、冰乙酸、氯化钠、氧化镁、硼酸、95%乙醇、甲基红、溴甲酚绿、甲基橙：国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TYAIB 024/10立式压力灭菌锅：宁波久兴医疗器械有限公司；SW-CJ-1F超净工作台：上海博迅实业有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱：广州深华生物技术有限公司；PHS-3E数字式pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；ZNBC-CL电热套：巩义市科瑞仪器有限公司；FA2004B电子天平：上海精科仪器有限公司；DF-101S集热式磁力搅拌加热器：金坛市医疗仪器厂；DW-HL218型超低温冷冻储存箱：中科美菱低温科技股份有限公司：FD5-3冷冻干燥机：广西东盟国际集团有限公司；KDN-08B型半自动凯氏定氮仪：上海新嘉电子有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 壳聚糖-咖啡酸衍生物的制备

在装有1%冰醋酸的去离子水（1 000 mL）大烧杯中加入10.00 g的壳聚糖，并在500 r/min的磁力搅拌器下不停歇搅拌8 h使壳聚糖溶解，溶解结束后装入试剂瓶静置备用。在250mL的三颈烧瓶中加入100mL制备好的壳聚糖溶液，再加入过氧化氢和抗坏血酸，不断搅拌30 min，后加入0.2 g的咖啡酸反应12 h，整个反应使用惰性气体氮气进行保护，以免除空气的影响。结束反应后用8 kDa～14 kDa透析袋透析反应溶液，以除去反应液中多余未反应的咖啡酸、VC等小分子化合物。透析池中蒸馏水每12 h更换一次，共透析72 h。透析结束后对透析液冷冻干燥，即得到壳聚糖-咖啡酸衍生物[17]。

1.3.2 涂膜溶液的配制

空白组：用去离子水清洗多宝鱼后，不做其它处理。

咖啡酸组：用去离子水配制质量分数为0.20%的咖啡酸溶液（含1%的冰醋酸）。

壳聚糖组：用去离子水配制成质量分数为2%的壳聚糖溶液（含1%的冰醋酸）。

壳聚糖咖啡酸混合物组：用去离子水配置含质量分数为0.20%的咖啡酸以及质量分数为1.8%的壳聚糖水溶液，制成混合涂膜液（含1%的冰醋酸）。

壳聚糖咖啡酸接枝物组：用去离子水配置质量分数为2%壳聚糖-咖啡酸衍生物的生物涂膜液。

1.3.3 涂膜保鲜设计

参照SC/T 3016-2004《水产品抽样方法》方法取样，除去鱼鳞、鱼皮等部分，取其腹部及背部肌肉，再将其肌肉搅碎，称取适量的样品放置于烧杯中，并分别加入5种涂膜处理溶液，浸泡0.5 h，沥干水分，晾干后用杀菌后的自封袋分装，分别贴好标签，全部放置于冰箱中冷藏（4℃）。之后每24 h取处理后的5组样品测其挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）含量、菌落总数、pH值、持水力等理化指标，并进行感官评价。

1.4 理化指标的测定

1.4.1 感官评价

由7名感官评定人员进行感官评价试验，冷藏和常温条件下的感官评定方法参照胡金鑫[18]的感官评定标准并稍作修改。

1.4.2 TVB-N含量的测定

按GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》半微量定氮法测定保鲜期间多宝鱼的挥发性盐基氮，测定3次取其平均值。

1.4.3 菌落总数

按照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》要求操作测定多宝鱼冷藏保鲜期间的菌落总数，测定3次取其平均值。

1.4.4 pH测定

待测样品10 g放入带有瓶塞的锥形瓶中，并加入100.0 mL去离子水，不停的摇晃，使样品在试液分布均匀，浸泡0.5 h后，用校正后的pH计测定其pH值，测定3次取其平均值。

1.4.5 持水力

取待测的多宝鱼样品，放置于双层滤纸之间，向其施加5 kg重的砝码，并保持2 min，其持水性以压出水分来表示。持水性按下式计算：

式中：w1为鱼肉质量，g；w2为除水后的质量，g；w为样品水分含量，%。

每组参数重复测量3次，按公式计算后取均值，作为持水性指标。

2 结果与分析

2.1 不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间感官评分变化

不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间感官评分变化见图1。

图1 不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间感官评分变化Fig.1 Sensory score changes of turbot after different coating treatments

由图1可以看出，感官评分下降最快的是未做涂膜处理的空白对照组，而下降最慢的是壳聚糖咖啡酸衍生物组，咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合组的评分差距较小。空白组从第2天开始，感官评分与其他处理组相比已经有了一定差距。到第3天的时候，空白组的评分已经在轻微腐败的评分范围以内。在第3天前，壳聚糖咖啡酸衍生物组与咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合组感官评分并没有特别明显的差异，但在第3天之后，用壳聚糖咖啡酸衍生物涂膜处理的多宝鱼感官评分明显比其他的组要高，且在试验末期壳聚糖咖啡酸衍生物涂膜处理的试验组评分仍在处于很高的水平内，其原因可能是与咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合物相比壳聚糖咖啡酸衍生物更加具有抗菌、抗氧化的能力。由此可反映出壳聚糖咖啡酸衍生物可以更好的抑制微生物繁殖，使鱼肉腐败减慢，使鱼的品质得到更好的保留，延长其货架期。

2.2 不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间TVB-N变化

不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间TVB-N变化见图2。

图2 不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间TVB-N变化Fig.2 TVB-N changes of turbot after different coating treatments

如图2所示。本次试验中TVB-N的初始值为7.8 mg/100 g。随着冷藏保鲜时间的增加，所有试验组的TVB-N的值均不断升高，且空白组的TVB-N值在第3天之后要明显要高于其他的涂膜组。壳聚糖咖啡酸衍生物组在整个冷藏保鲜期间的TVB-N值都明显低于空白、咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合试验对照组。冷藏保鲜的第3天咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合试验对照组TVB-N值均不在一级鲜肉标准（15 mg/100 g）范围以内，不属于一级鲜肉，而空白对照组在第2天的时候就已经超出一级标准范围，并且试验末期（第5天）空白对照组已经超出了二级鲜肉标准（30 mg/100 g）范围，在整个试验过程中壳聚糖咖啡酸衍生物组的TVB-N值均在一级鲜肉标准范围内。TVB-N主要是由于鱼肉中存在的细菌腐败分解产生，壳聚糖咖啡酸衍生物组TVB-N的值较低的原因是因为与咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合试验对照组相比，壳聚糖咖啡酸衍生物涂膜处理能够使微生物的生长繁殖受到阻碍，使鱼肉中蛋白质等营养物质的分解得到抑制，使得保鲜效果更加的明显。

2.3 不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间菌落总数变化

不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间菌落总数变化见图3。

图3 不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间菌落总数变化Fig.3 Total number of colonies changes of turbot after different coating treatments

菌落总数的测定是衡量多宝鱼等肉类产品腐败程度的一个重要指标，鱼肉内的微生物会分解鱼肉蛋白、氨基酸等营养物质，并且还会生成既有腐败性征味道的生氨、胺类（腐胺、尸胺、组胺）等物质，因而检测于体内的菌落总数可以反映出鱼肉的腐败情况。

从图3可以看出随着冷藏保鲜天数的增加，不同处理组的菌落总数也在不断地升高。在第3天之后空白、咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合组的菌落数值明显高于壳聚糖咖啡酸衍生物组。空白、咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合组在第3天的时候菌落总数便超过了国家鲜肉标准（lg CFU/g-1=6.0）。同时在试验末期壳聚糖咖啡酸衍生物组对微生物的抑制作用仍大于咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合组并尚在国家鲜肉标准的范围内。由此可反映出相较于其他处理组，壳聚糖咖啡酸衍生物能够更好的抑制微生物的生长和增值，起到良好的保鲜作用。

2.4 不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间pH值变化

不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间pH值变化见图4。

多宝鱼等水产品在其保鲜储藏过程中，鱼肉的蛋白质等营养物质在微生物和其生理条件的作用下，被分解为一些小分子的碱性物质，因此鱼肉的pH值会产生一定的变化。pH值的变化反映了鱼体本身的一个酸碱度，一定程度上反映出了多宝鱼死后的新鲜程度[19]。

从图4可看出，本次试验的样品pH值都基本是先下降而后再不断上升。原因是在鱼肉冷藏保鲜的初期，鱼肉内的发生糖酵解反应，从而生成乳酸、腺苷三磷酸、磷酸肌酸等酸性物质，从而导致了pH值的值下降。试验的起始pH值较低，可能与涂膜液本身的pH值较低有关[17]。而随着冷藏保鲜时间的增加，微生物的繁殖变快，会使蛋白质快速分解，并产生氨类等碱性物质，从而使得pH值升高。本试验的初始pH值为6.65，冷藏期间（第2天之后）空白组的pH值明显高于其他有涂膜处理的试验组，且在整个冷藏期间空白组、咖啡酸组、壳聚糖组、壳聚糖+咖啡酸混合组的pH值都比的壳聚糖咖啡酸衍生物组的pH值要高，壳聚糖咖啡酸衍生物pH值最低。说明在冷藏期间壳聚糖咖啡酸衍生物涂膜处理的多宝鱼肉腐败相对于其他的组较为缓慢。由此可知壳聚糖咖啡酸衍生物涂膜液的保鲜效果最佳。

图4 不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间pH值变化Fig.4 pH value changes of turbot after different coating treatments

2.5 不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间持水力变化

不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间持水力变化见图5。

图5 不同涂膜处理后多宝鱼保鲜期间持水力变化Fig.5 Water holding capacity changes of turbot after different coating treatments

鱼肉的持水性用持水力作为考察指标，其表示的是当鱼肉受到外力作用时保持水分的一种能力，在鱼肉蛋白中，蛋白质存在着一种三维的网状结构，水分子就镶嵌在其中，当这种三维网状结构被毁坏时，水分子就被释放出来，从而导致了持水力的降低[20]。冷藏保鲜过程中持水力的数值越高，说明保水的性能越好，保鲜起到的效果就越好。

如图5所示，在整个冷藏保鲜期间，所有的多宝鱼样品的持水力均呈下降的趋势。在第2天之后咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合组与壳聚糖咖啡酸衍生物组的持水力对比更加的明显，在第3天之后空白组对比其他的涂膜保鲜组持水力也有了比较明显的区别。在整个试验过程中咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合组的持水力差别不大（差值＜1）。多宝鱼的持水力与其肌球蛋白变性有关，咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合、壳聚糖咖啡酸衍生物的涂膜液能够对多宝鱼肉形成一个保护的薄膜，从而抑制了其肌球蛋白变性。而肌球蛋白变性与其水化能力有着一定的联系。而壳聚糖涂膜材料又减慢了微生物的繁殖，使蛋白质变性减缓，也使得与空白组相比涂膜组的持水力相对较高。从图中可以看出咖啡酸衍生物组的持水力变化最为平缓，持水力液相对较高，说明壳聚糖咖啡酸衍生物与其它的试验组对比有着更好的保持鱼肉内游离水分的能力。

3 结论

本文以壳聚糖为主体，利用壳聚糖上氨基和羟基作为接枝点，通过接聚共聚反应引入咖啡酸，形成新的壳聚糖咖啡酸衍生物。并以挥发性盐基氮、菌落总数、pH值、持水力以及感官评价作为评价指标，分析了0.20%的咖啡酸，2%的壳聚糖，0.20%的咖啡酸以及1.8%的壳聚糖，2%壳聚糖-咖啡酸衍生物，无菌水对多宝鱼的保鲜效果。结果表明经壳聚糖咖啡酸衍生物处理后的多宝鱼，在冷藏保鲜过程中的pH值、菌落总数和挥发性盐基氮均比咖啡酸、壳聚糖、壳聚糖+咖啡酸混合涂膜处理的试验组要低，而感官评分则高于对比涂膜处理组。本次试验中采用壳聚糖咖啡酸衍生物的多宝鱼在整个保鲜过程中各项指标均保持在安全可食用范围内，而其他试验组在第3天之后各项数据均以超出安全可食用范围。说明壳聚糖咖啡酸衍生物可以起到更加稳定的抗氧化和抑制微生物的生长作用，使多宝鱼的腐败变质得到减慢，起到了更加良好的保鲜效果。