植物乳杆菌蚕豆发酵饮料的制备与抗氧化性研究

李春林，李春阳

（1.江苏连云港中等专业学校，江苏连云港222000；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京210014）

近年来，乳酸菌发酵果蔬饮料得到了许多研究者的关注，番木瓜[1]、怀山药[2]、小麦苗[3]等均采用乳酸菌发酵被加工为发酵饮料。发酵后的果蔬饮料不仅具有更好的风味和独特的口感，而且可以增加果蔬饮料维生素含量，提高其营养价值[4]。蚕豆（Vicia faba L.）属豆科蚕豆属作物，别名胡豆、佛豆、罗汉豆、野豌豆等，起源于亚洲的西部和中部[5]。蚕豆有着悠久的食用历史，营养价值高，其中的蛋白质含量非常丰富，含量高达21%，在所有的豆科类植物中，含量只略低于大豆[6]。中医认为，蚕豆性平，可以促进肠胃的吸收功能，对水肿、喉部出血、高血压、食欲底下、中气不足等症状有治疗功效[7]。蚕豆在我国栽培历史悠久，是我国目前种植面积和产量位居第三的食用豆类作物，常年播种面积在100万公顷左右，产量在150万～200万吨之间，分别占世界蚕豆种植面积和总产量的53%和61%，其中很大一部分用来以鲜荚形式直接进入市场[8-9]。除此以外，蚕豆还可以被加工为罐头[10]、膨化食品[11]、淀粉[12]以及功能性食品[13]。但以蚕豆为原料，利用乳酸菌制备发酵饮料尚未见报道。本试验采用植物乳杆菌制备蚕豆发酵饮料，优化发酵工艺参数，改善风味，并分析发酵对蚕豆饮料抗氧化性的影响，为蚕豆的深加工提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蚕豆：市购；中温 α-淀粉酶（50 000 U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；直投式植物乳杆菌：常州益菌加生物科技有限公司；白砂糖：广州华糖食品有限公司；黄原胶、羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）、结冷胶等均为食品级：市售；1，1-二苯基-2-苦基肼：美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WK-801榨汁机：佛山微格电器有限公司；L550台式低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HPX-9052 MBE培养箱：上海博迅实业有限公司；721S可见分光光度计：上海棱光技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蚕豆发酵饮料的制备

选择颗粒饱满，无杂质、霉变和虫蛀的蚕豆，用水冲洗3遍除去原料中的杂质，然后在75℃的水浴中浸泡60 min。将浸泡后的蚕豆以料水比1∶12（g/mL）的比例打浆，加入中温α-淀粉酶，在70℃下酶解50 min。酶解液采用200目滤布双层过滤，煮沸10 min，立即冷却至25℃备用。

蚕豆酶解液加入直投式植物乳杆菌，搅拌均匀，在培养箱中发酵一定时间，加入白砂糖，0.04%黄原胶、0.15%CMC-Na、0.06%结冷胶，加热至60℃，25 MPa均质2次后灌装，95℃杀菌10min，取出后分段冷却。工艺流程如下：

蚕豆→清洗去杂→浸泡→打浆→酶解→过滤→煮沸→冷却→接种→发酵→配料→均质→灌装→杀菌→冷却

1.3.2 植物乳杆菌发酵单因素试验

以发酵后的酸度为评价指标，固定接种量为0.5%，发酵时间为 16 h，设置发酵温度为 30、35、40、45 ℃，考察发酵温度对发酵的影响；固定发酵温度35℃，发酵时间16 h，设定植物乳杆菌的接种量分别为0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%，考察接种量对发酵的影响；固定植物乳杆菌接种量0.5%，发酵温度35℃，将蚕豆料液分别发酵 16、24、32、40、48 h，考察发酵时间对发酵的影响。

1.3.3 发酵工艺优化

在单因素试验的基础上，以发酵液酸度为指标，采用Box-Behnken Design响应面试验优化发酵工艺参数。响应面试验因素水平如表1所示。

表1 响应面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methods

1.3.4 白砂糖添加量对蚕豆发酵饮料感官品质的影响

蚕豆料液发酵后的酸度很高，需要加入白砂糖来调节酸甜比。在发酵后的蚕豆饮料中分别添加不同的白砂糖，考察加糖量对饮料感官评分的影响。感官评价由15位人员进行，根据对饮料的喜好程度分别打分（非常不喜欢为1，不喜欢为2分，一般喜欢为3分，喜欢为4分，非常喜欢为5分）。

1.3.5 酸度的测定

采取NaOH滴定法测蚕豆发酵饮料的酸度[14]。

1.3.6 抗氧化性的测定

配制浓度为50 μg/mL的VC，将发酵前后的样液在3 000 r/min的转速下离心10 min，取上清液，将上清液稀释5倍后作为待测液，测定VC与蚕豆饮料羟基自由基清除率[15]、DPPH自由基清除率[16]以及还原力[17]。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌发酵最佳工艺参数

2.1.1 发酵温度对酸度的影响

发酵温度对产酸的影响如图1所示。

由图1可见，发酵温度为35℃时，蚕豆发酵饮料的酸度最高，过低或者过高的发酵温度都会抑制植物乳杆菌产酸。这是由于植物乳杆菌的最佳适用温度为30℃～40℃，在此温度下有利于乳杆菌的生长繁殖。在植物乳杆菌发酵黄秋葵、柚子汁等研究中也发现，当发酵温度增加到35℃时，饮料中的活菌数达到最大值，产酸较多[18-19]。因此，选择发酵温度为35℃。

图1 发酵温度对产酸的影响Fig.1 Influence of fermentation temperature on acid production

2.1.2 接种量对蚕豆饮料酸度的影响

接种量对产酸的影响如图2所示。

图2 接种量对产酸的影响Fig.2 Effect of inoculation on acid production

由图2可见，随着接种量的增加，酸度随之增大。当接种量大于0.5%以后，酸度增加速率减小。乳杆菌价格昂贵，本着节约成本的原则，选取接种量较低、酸度较高的发酵条件，后期可以通过添加糖中和酸对感官品质的影响。因此，对接种量与酸度进行min-max标准化，统一评价标准，进行标准化求和，结果如图3所示。

图3 Min-max标准化求和Fig.3 Min-max standardized summation

由图3可见，在接种量为0.5%时，min-max标准化求和的值最高。因此，选择0.5%为较适宜的接种量。

2.1.3 发酵时间对酸度的影响

发酵时间对产酸的影响如图4所示。

图4 发酵时间对产酸的影响Fig.4 Influence of fermentation time on acidity

由图4可知，随着发酵时间的增加，蚕豆发酵饮料的酸度逐渐上升。在发酵时间到达40 h后，产酸量增加的幅度慢慢趋于恒定。这是由于植物乳杆菌利用原料中的碳水化合物不断产酸，一直升高的酸度及其代谢产物对菌的生长具有抑制和杀灭作用，从而抑制了其生长，饮料的酸度基本保持不变[3]。综合考虑，初步确定发酵时间在40 h左右。

2.1.4 发酵工艺响应试验结果

在单因素试验的基础上，以蚕豆发酵饮料的酸度为指标，对接种量、发酵时间、发酵温度进行响应面试验，优化发酵工艺参数，响应面试验设计及结果如表2所示。

表2 响应面优化试验设计及结果Table 2 Design and result of response surface optimization test

利用Design-Expert软件对表2中的酸度进行回归拟合，得到二次多项回归方程：酸度/%=15.5A+0.107 5B+4.442 5C－1.026 96×10-14AB+0.02AC+0.017 5BC－13.25A2－0.007 656 25B2－0.069 5C2。

对上述响应面模型进行显著性分析，结果如表3所示。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表中模型p=0.000 5，说明该模型非常显著。在模型中，一次项 A（p＜0.05）显著，B、C 和二次项 C2非常显著（p＜0.01）；各发酵因素对酸度的影响次序是 C＞B＞A。相关系数R2=0.9845，表明此模型的拟合度十分好，能很好地描述因素与响应值之间的关系，可以解释98.45%的变化。R2Adj=0.956 5，说明试验误差小，可信度较高。因此，此模型较为可靠。

根据上述二次多项回归方程可得，当接种量为0.6%，发酵温度为37.09℃，酶解时间为40 h时，发酵饮料酸度的预测值达15.36%。为便于生产操作，将发酵温度修正为37℃。在最优条件下制备蚕豆发酵饮料，测得酸度为15.25%，与理论值相差不大，说明模型较为可靠，具有可行性。

2.2 加糖量对感官品质的影响

加糖量对感官品质的影响见图5。

由图5可见，当白砂糖的添加量为8%时，饮料的感官评分最高，所制备的蚕豆发酵饮料酸甜可口，风味优良，因此，选择白砂糖的添加量为8%。

2.3 发酵对蚕豆饮料抗氧化性的影响

2.3.1 发酵对蚕豆饮料清除OH·能力的影响

发酵对OH·清除能力的影响见图6。

图5 白砂糖添加量对饮料感官评分的影响Fig.5 Effect of sucrose addition on the sensory score of beverage

图6 发酵对OH·清除能力的影响Fig.6 Effects of fermentation on OH·scavenging power of broad bean beverage

由图6可见，蚕豆饮料发酵后对OH·清除能力增加，与浓度呈现一定的量效关系，但是清除能力小于浓度为50 μg/mL的VC。在取样量达到0.6 mL后，发酵前后蚕豆饮料对OH·清除能力趋于平缓。李倩等[20]利用植物乳杆菌发酵辣木叶提取液后，发现发酵后OH·清除能力为先升后降的趋势，但是整个发酵过程中的自由基清除能力均高于未发酵辣木叶提取液。复合乳酸菌发酵怀山药的研究发现，发酵前后饮料的OH·清除能力均高于VC，但是发酵前后并没有显著性差异[21]

2.3.2 发酵对蚕豆饮料清除DPPH·能力的影响

发酵对蚕豆饮料DPPH·清除率的影响见图7。

图7 发酵对蚕豆饮料DPPH·清除率的影响Fig.7 Effects of fermentation on DPPH·scavenging power of broad bean beverage

如图7所示，蚕豆饮料对DPPH·清除率随着取样量的增加而增加，并且发酵后蚕豆饮料对自由基的清除能力提高，但是二者都低于浓度为50 μg/mL的VC。有研究表明，果蔬、谷物等食品对DPPH·清除能力随着发酵时间的增加而提高，这与其中多酚类物质的增加有关[21-22]。但是也有研究发现，果蔬饮料在发酵过程中可能由于黄酮类物质的不稳定性和发酵过程中产生了分解酚类物质的酶，对DPPH·清除率随时间变会呈现先增加后变化趋势[23]。

2.3.3 发酵对蚕豆饮料还原力的影响

发酵对蚕豆饮料还原力的影响见图8。

图8 发酵对蚕豆饮料还原力的影响Fig.8 Effects of fermentation on reducing power of broad bean beverage

由图8可见，还原力与取样量呈一定的量效关系。随着取样量的增加，样品的还原力也增加。发酵后饮料的还原力大于发酵前，但是二者的还原力都小于50 μg/mL 的 VC。

3 结论

植物乳杆菌可用于蚕豆发酵饮料的制备，最佳发酵工艺参数为接种量0.6%，发酵时间40 h，发酵温度37℃，在此条件下制备的饮料酸度为15.25%。在发酵液中添加8%的糖，所得蚕豆发酵饮料酸甜可口，风味良好。发酵提高了蚕豆饮料的抗氧化性，但是始终小于50 μg/mL的VC。因此利用植物乳杆菌发酵蚕豆可改善饮料的风味，得到抗氧化活性较高的蚕豆发酵饮料。但由于饮料中抗氧化体系较为复杂，对其抗氧化活性作用的机理尚不明确，有待于继续深入研究其抗氧化机理，为蚕豆饮料产品的开发奠定基础。