河南产白蒿精油的化学成分分析及抑菌活性研究

（郑州师范学院化学化工学院，河南郑州450044）

食品腐败是一个全球性的问题，数以百万计的人遭受着由食物传播的痛苦感染。因此，迫切需要寻找新型、有效、安全的抗菌药物。植物精油能以接触或熏蒸的方式在食物周围形成抑菌氛围而达到防腐保鲜[1-2]，是人类开发绿色抗氧化剂和抗菌防腐剂的重要原料。蒿类植物在地球上分布广泛，气味浓郁，富含精油，多数具有杀菌灭虫之功效，在医疗、保健、食品保鲜、化妆品等领域具有潜在的应用前景。如吴克刚等[3]研究了芳香植物精油对食品常见腐败微生物抗菌活性作用，试验表明，腐败微生物对植物精油表现出不同的敏感性；崔惠敬等[4]研究了植物精油对大菱鲆弧菌的体外和体内抗菌活性，发现14种待测植物精油对大菱鲆弧菌具有不同程度的抑制效果，其中肉桂醛的抗菌活性最强；Zahra M等[5]研究发现，黄连木挥发油重要成分a-蒎烯对消化性溃疡有一定的保护作用；段伟丽等[6]研究表明，艾蒿精油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌均有抑制作用。白蒿（Herba artimisiae sieversianae）又称茵陈、大籽蒿、猪毛蒿等。医学研究表明白蒿具有清热解毒、抗菌消炎、祛湿消肿、抗氧化、抗艾滋病等功效[7]。

本研究以河南产白蒿植物为原料，采用水蒸气蒸馏法提取精油，通过傅里叶变换红外光谱（Fourier transform-infrared spectroscopy，FT-IR） 和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS） 联用仪对精油成分进行了分析，并就白蒿精油对大肠杆菌、四联球菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制活性进行了探究，旨在寻求一种绿色安全、无污染的食品防腐剂，也为白蒿中药资源的综合利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

TFT-1310气相色谱-质谱仪器：赛默飞世尔科技有限公司；FTIR-650红外光谱仪器：津港东科技发展股份有限公司；LX-07A万能高速粉碎机：红光工贸有限公司；FA116分析天平：上海海康电子仪器；DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱：上海景洪试验设备有限公司；DHP-2150电热恒温培养箱：郑州生元仪器有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：苏州净化设备有限公司；MLS-3781L-PC高压蒸汽灭菌锅：松下健康医疗器械株式会社。

白蒿原料：白蒿植物地上部分，于6月初采于河南信阳光山，阴干保存，粉碎备用；大肠杆菌、四联球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌种：郑州师范学院生命科学学院微生物试验室；乙醚、丙酮、二甲基亚砜、氯化钠、无水硫酸钠试剂均为分析纯：天津市科密欧化学试剂有限公司；琼脂、蛋白胨、牛肉膏等：上海国药试剂集团；试验用蒸馏水均为二次蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 白蒿精油的提取

将采集的新鲜白蒿材料去杆阴干，粉碎成末，准确称量10份，每份30 g，分别放进500 mL的圆底烧瓶里，以料液比1∶10（g/mL）的量加入蒸馏水，室温（20℃）浸提8 h后加入1g氯化钠，几粒沸石，采用简易水蒸气蒸馏装置（烧瓶、恒压漏斗、球形冷凝管）对白蒿精油进行提取，每隔10 min转移一次馏出液，直至恒压漏斗上层无油状物为止，约回流2 h。将馏出液转至分液漏斗中，加入4 mL乙醚萃取3次，醚层经无水硫酸钠干燥后水浴加热蒸除乙醚，即得精油，称重。置于4℃冰箱里密封保存。

1.2.2 白蒿精油的成分分析

将提取出来白蒿精油用丙酮稀释后，采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对精油成分进行测定分析。色谱条件：色谱柱为ZB-5熔融石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。载气：氦气；流速：1.0 mL/min；进样方式：分流比 1 ∶10，进样量：1 μL。程序升温柱温：初始温度60℃，保留3 min；以6℃/min升至260℃并保持10 min。质谱条件：离子源为电子轰击离子源（electron impact ion source，EI），电子能量 70 eV，离子源温度200℃。扫描范围：30 amu～500 amu，扫描速率0.2 scans/s。用计算机谱库NIST进行检索。

采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对获得的精油样品进行表征。检测条件为：KBr压片法，测定范围4 000 cm-1～500 cm-1。

1.2.3 白蒿精油的抑菌试验

1.2.3.1 菌悬液的制备

培养基的制备：在大烧杯中加入250 mL蒸馏水、1%的蛋白胨、0.3%牛肉膏、0.5%氯化钠，1.5%琼脂粉，加热搅拌均匀。将配置好的培养基分装在锥形瓶中，用封口膜封好，放入高压蒸汽灭菌锅中在120℃下灭菌2 h。

细菌接种及扩培：在紫外灯灭菌30 min，通风10 min的超净工作台上，将培养基倒入无菌空白培养皿上，待培养基冷却凝固后，用接种环将大肠杆菌、四联球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌菌株分别接种于上述培养基中，倒置于37℃恒温培养箱中培养24 h。将活化后的细菌用接种环，接种于新的培养液，37℃恒温培养24 h，使用平板计数法调整浓度为 106CFU/mL～107CFU/mL，即得菌悬液[8]，备用。

1.2.3.2 白蒿精油抑菌剂的制备

白蒿精油以体积分数为5%的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）水溶液为溶剂，对其进行溶解稀释，配制浓度分别为 100、52、26、17 mg/mL 的精油抑菌剂，并设置溶剂空白对照试验。

1.2.3.3 抑菌性测定

采用滤纸片法进行抑菌试验的测定。具体操作如下：用移液枪分别吸取100 μL菌悬液到培养皿中，使用灭菌涂布棒将细菌涂布于培养基表面。用无菌镊子，夹取浸有白蒿精油抑菌剂的3片滤纸片置于含菌平板上，每个平板有3个样品，37℃恒温培养24 h，同时设置溶剂空白试验，通过测定抑菌圈直径以评估抑菌活性大小。

1.2.3.4 最低抑菌浓度的测定

最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的测定参照文献[6]，采用平板法。先在试管中以5%二甲基亚砜溶剂稀释配制一系列浓度的白蒿精油溶液，精油浓度范围在 0.5 μL/mL～50 μL/mL，每个试管中加入50 μL上述配制的菌悬液。以体积分数5%的二甲基亚砜为对照，37℃培养24 h，每管取100 μL涂布，培养24 h，观察细菌生长状况，以平板无细菌生长的精油体积分数作为最低抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 白蒿精油的红外光谱分析

以KBr压片，采用FT-IR对获得的白蒿精油样品进行表征，测定范围4 000 cm-1～500 cm-1，红外光谱如图1所示。

图1 白蒿精油红外光谱Fig.1 FT-IR spectra of essential oil from Herba artimisiae Sieversianae

由图1可知，3 421 cm-1处较强的吸收峰为羟基O-H的伸缩振动，说明白蒿精油中含有较多的醇类物质；2 921 cm-1处为CH3和CH2的C-H伸缩振动吸收峰，1 631 cm-1处为C=C的伸缩振动吸收，1 600 cm-1～1 450 cm-1处的多重峰为苯环骨架的特征吸收峰，提示白蒿精油中含有较多的挥发性烯烃及芳香类有机物。

2.2 白蒿精油的GC-MS分析

采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对白蒿精油化学成分进行了检测，得到白蒿精油的总离子流如图2。

图2 白蒿精油气相色谱-质谱分析总离子流图Fig.2 GC-MS total ion current chromatogram of essential oil from Herba artimisiae Sieversianae

由图2可知，白蒿精油成分较复杂，从白蒿精油中分离出约63种组分。通过计算机NIST-MS谱库自动检索各组分的质谱数据，并对结果参考有关标准图谱比对和人工分析，以面积归一化法计算出精油各组分的相对含量，其主要化学成分及含量见表1。

由表1和图2可知，共鉴定出河南产白蒿精油中的主要化合物26种，占精油总含量的85.05%，主要成分有氧化石竹烯（15.24%）、镰叶芹醇（14.34%）、大根香叶三烯-1-醇（8.90%）、桉油烯醇（6.61%）、棕榈酸（5.72%）、α-毕橙茄醇（5.19%）、香橙烯氧化物（3.71%）、亚麻酸（2.64%）、蓝桉醇（2.58%）等。从精油化学成分的类别上看，白蒿精油含有较多的醇类、烯烃成分，这与红外光谱图得出的结论一致。据文献调研，镰叶芹醇、大根香叶三烯-1-醇、桉油烯醇等物质具有光谱抗菌的作用，其中镰叶芹醇还有抗肿瘤、抗凝血、镇静镇痛等医药功效。白蒿精油的化学成分及其含量也与其它文献报道的结果相差较大，刘群等[9]从长春野生白蒿中提取的挥发油主要化学成分为1，8-桉叶油素、反-丁香烯、顺-丁香烯和樟脑等；Suleimenov E M等[10]对采自哈萨克斯坦的白蒿精油进行分析，发现其主要含有月桂烯、桉油精、芳樟醇、对伞花烃等；李海亮等[11]从其白蒿精油中共鉴定48种化合物，其中红没药醇、兰香油奥2种组分总含量占精油总量的50%以上。这些差异可能与白蒿的产地、气候、生长环境以及提取条件等因素有密切关系。

表1 白蒿精油化学成分含量表Table 1 Chemical composition of essential oil from Herba artimisiae Sieversianae

2.3 白蒿精油抑菌试验结果分析

按照1.2.3中抑菌性测定方法，以5%二甲基亚砜溶剂空白试验为参照，采用滤纸片法进行抑菌活性测定，以抑菌圈直径大小评估抑菌活性。抑菌圈直径大于20 mm时为极敏；16 mm～20 mm为高敏；11 mm～15 mm为中敏；8 mm～10 mm为低敏；小于8 mm为不敏感[12]。5%二甲基亚砜溶剂及不同浓度的白蒿精油抑菌剂对大肠杆菌、四联球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌试验结果见表2。

表2 白蒿精油对4种待试菌的抑菌活性Table 2 Antimicrobial activities of essential oil from Herba artimisiae Sieversianae against 4 tested microbes

由表2可知，5%二甲基亚砜溶剂对4种待测细菌的抑菌能力较弱，抑菌圈直径基本接近7 mm，最大仅为7.5 mm。其抑菌效果见图3。

图3 二甲基亚砜溶剂抑菌效果图Fig.3 Antibacterial activities of DMSO solvent against 4 tested microbes

二甲基亚砜溶剂对四联球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌几乎没有抑菌性，对蜡样芽孢杆菌有微弱的抑菌性，因此选取5%二甲基亚砜作为精油的溶解试剂可行。

通过对表2数据对比发现，白蒿精油对大肠杆菌、四联球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌4种受试菌均有较强的抑菌作用，同一浓度的白蒿精油抑菌液对不同的菌株抑菌能力不同。浓度为100 mg/mL的精油抗菌效果如图4所示。

白蒿精油对枯草芽孢杆菌抗性效果最好，100mg/mL浓度的抑菌试验中抑菌圈直径可达22.20 mm，对蜡样芽孢杆菌抗性稍差，抑菌圈为15.50 mm。

不同浓度的精油抑菌液抑菌效果对比发现，随着精油抑菌液浓度的升高，抑菌圈直径增大，抑菌能力增强，如图5所示。

图4 同一浓度（100 mg/mL）白蒿精油对不同细菌的抑菌效果图Fig.4 Antimicrobial activities of essential oil with 100 mg/mL from Herba Artimisiae Sieversianae against 4 tested microbe

图5 不同浓度的白蒿精油对四联球菌的抑菌效果图Fig.5 Antimicrobial activities of essential oil with different concentrations from Herba artimisiae Sieversianae against Micrococcus tetragenus

17 mg/mL浓度的白蒿精油对四联球菌的抑菌圈直径仅为9.00 mm，而浓度为100 mg/mL时，抑菌圈直径达到20.67 mm，为前者的2.29倍。

为了进一步了解白蒿精油对4种受试菌的抑菌效果，就白蒿精油对4种受试菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）进行了测定，结果见表3。

由表3可发现，不同菌种对白蒿精油的抗性不同，最低抑菌浓度也不同。其中精油对枯草芽孢杆菌最低抑菌浓度最小，仅为2.5 μL/mL；对四联球菌和大肠杆菌最低抑菌浓度均为5 μL/mL；对蜡样芽孢杆菌的最低抑菌浓度为10 μL/mL。可见，极少量的白蒿精油即可抑制细菌生长，在实际应用中可大大节省成本。

表3 白蒿精油对供试菌种的最低抑菌浓度Table 3 Minimal inhibitory concentrations of essential oils from Herba artimisiae Sieversianae against 4 tested microbes

3 总结与展望

本研究采用水蒸气蒸馏法提取白蒿植物精油，采用红外光谱（FT-IR）及气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对精油化学成分进行检测和分析，共鉴定出河南产白蒿精油中的主要化合物26种，占精油总含量的85.05%，主要成分有氧化石竹烯、镰叶芹醇、大根香叶三烯-1-醇、桉油烯醇、棕榈酸、α-毕橙茄醇、香橙烯氧化物、亚麻酸、蓝桉醇等。

通过对河南产白蒿精油的抑菌活性研究发现，精油对大肠杆菌、四联球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌4种受试细菌均有一定的抑制作用，其中对枯草芽孢杆菌抑制活性最强而对蜡样芽孢杆菌较弱，在试验浓度下，对枯草芽孢杆菌最大抑菌圈直径达到了22.20 mm，显示了极敏性。抑菌试验结果提示白蒿精油含有较强抑菌活性的化学成分，这对于白蒿药材的研发及天然食品防腐剂的开发提供了理论参考。

随着社会的高速发展以及人们对生活品质要求的不断提高，越来越多人的更加倾向选择天然产物添加的产品。蒿类植物种类丰富，遍布世界各地，取材方便，价格低廉，其植物精油香气浓郁，可作香料，又具有抗菌作用，在未来的食品、医疗领域将具有巨大的应用前景。