大高良姜抑菌成分提取工艺优化及稳定性研究

■黄百祺 胡林青 王如意 李咏梅 吴巨贤*

（1.广东科贸职业学院食品与生物工程学院，广东广州510430；2.广东食品药品职业学院实验实训中心，广东广州510520）

近年来，由于在养殖过程中不合理使用抗生素导致细菌的耐药性不断升级，甚至出现多重耐药性，开发新型饲用抗菌药物迫在眉睫。我国具有大量宝贵的中药资源，无论在感染控制还是在现代医疗方面都显示出独特优势，成为抗生素替代物的重要来源之一。

大高良姜[Alpinia galanga (L.) Willd.]为姜科山姜属植物红豆蔻的根茎，民间常用作烹调加工香料。已探明大高良姜含有挥发油类、二苯庚烷类、黄酮类、苯丙素类、糖苷类等多种活性成分[1-2]，具有抗癌、抗氧化、抗溃疡和抑制黄嘌呤氧化酶等作用[3-5]。研究报道大高良姜的同属植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）具有较好的抑菌活性，如李钟美等[6]研究表明高良姜提取物具有广泛的抑菌谱，抑菌效果强于常用食品防腐剂山梨酸钾、苯甲酸钠；汪光华等[7]考察了高良姜中4种黄酮类化合物的抑菌活性，发现金黄色葡萄球菌对其较敏感，而黑曲霉、大肠杆菌、白色念珠菌等对其敏感性较低；Rao 等[8]研究了高良姜提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）与最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）。但是，目前未见有大高良姜提取物抑菌活性与提取工艺的相关研究。

本试验旨在研究大高良姜不同溶剂提取物对饲料微生物污染中常见的4种细菌和2种真菌体外抑菌活性的影响，通过正交试验优化乙醇回流提取工艺，测定提取物的MIC、MBC以及对pH值、热和紫外光的稳定性，为进一步开发利用大高良姜资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大高良姜购于广东省惠来县农贸市场，经广东省中药研究所黄意成主管中药师鉴定为山姜属红豆蔻的根茎大高良姜。

金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠杆菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、白色念珠菌（ATCC10231）购自温州市康泰生物科技有限公司。 枯 草 芽 孢 杆 菌（ATCC6633）、黑 曲 霉（ATCC16404）由广东科贸职业学院食品与生物工程学院微生物实验室提供。

1.2 主要试剂

水解酪蛋白琼脂、葡萄糖美兰水解酪蛋白琼脂购自杭州滨和微生物试剂有限公司；水解酪蛋白胨肉汤购自广东环凯微生物有限公司；庆大霉素药敏纸片（10 μg/片）、空白药敏纸片购自温州市康泰生物科技有限公司；伏立康唑药敏纸片（1 μg/片）购自OXOID公司；其余试剂为国产分析纯。

1.3 主要仪器

BPMJ-150F 型恒温培养箱、DZF-6050 型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；WGZ-2XJ 型浊度计（上海昕瑞仪器仪表有限公司）；FE20K 型pH计[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]。

1.4 试验方法

1.4.1 提取溶剂和指示菌筛选

1.4.1.1 提取液及抑菌纸片制备

新鲜大高良姜除杂、洗净后切片，于55 ℃烘干后粉碎，粉末过80 目筛，4 ℃保存备用。准确称取大高良姜粉末4.0 g，按料液比1∶10（m∶V），分别以纯化水、无水乙醇、乙酸乙酯和石油醚为溶剂，60 ℃搅拌回流提取3 h，抽滤除渣得各大高良姜提取液。提取液分别以0.22 μm无菌滤膜除菌，充分浸泡无菌空白药敏纸片3 h，于55 ℃无菌条件下烘干，得各溶剂提取液的抑菌纸片。以各空白溶剂按上法制取阴性对照纸片。

1.4.1.2 抑菌试验（纸片扩散法[9]）

分别挑取各试验菌种单菌落至盛有适量灭菌生理盐水的试管中，以0.5 号麦氏比浊管为参比调整菌悬液至相同浊度。用灭菌棉签沾取少量菌悬液，于平板（细菌使用水解酪蛋白琼脂培养基，真菌使用葡萄糖美兰水解酪蛋白琼脂培养基）上进行涂布。待涂布稍干后贴片，以各空白溶剂纸片为阴性对照，庆大霉素（细菌）和伏立康唑（真菌）药敏纸片为阳性对照。贴片完毕，细菌和真菌平板分别置于37 ℃和28 ℃恒温培养18 h和36 h，用游标卡尺以十字交叉法测量抑菌圈直径，每组试验重复三次。

1.4.2 正交试验优化提取工艺

以1.4.1.2 节结果中细菌和真菌抑菌圈分别最大的金黄色葡萄球菌和黑曲霉为指示菌，以乙醇为提取溶剂，设计四因素三水平正交试验[L9(34)]，考察乙醇浓度（A）、提取温度（B）、提取时间（C）和液料比（D）等因素对大高良姜提取物抑菌活性的影响，每组试验重复三次，并按最佳工艺条件验证三次。试验因素和水平见表1。

1.4.3 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定[10]

按正交试验最佳工艺条件进行提取，提取液于55 ℃真空干燥至恒重。准确称取干燥提取物1.0 g，置于10.0 ml 棕色容量瓶中，以纯化水溶解并稀释至刻度，用0.22 μm 无菌滤膜除菌，取适量至水解酪蛋白胨肉汤试管中，以二倍递减稀释法将肉汤中提取物的 浓 度 依 次 稀 释 至10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.019 5 mg/ml。分别将金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌悬液（调至与0.5 号麦氏比浊管相同浊度）接入含各浓度提取物的水解酪蛋白胨肉汤中，每管10 μl，以灭菌纯化水为空白对照。各试管分别置于37 ℃（金黄色葡萄球菌）和28 ℃（黑曲霉）、200 r/min培养24 h，以无菌生长的最小浓度为大高良姜提取物的MIC，每组试验重复三次。

表1 正交试验因素及水平

在MIC的基础上将各试管继续培养12 h，以无菌生长的最小浓度为大高良姜提取物的MBC，每组试验重复三次。

1.4.4 大高良姜提取物稳定性研究

按1.4.2节优化后的提取工艺制备大高良姜提取物，以金黄色葡萄球菌和黑曲霉为指示菌，考察pH值、温度、紫外光照射时间对提取物抑菌活性的影响。

1.4.4.1 大高良姜提取物的pH值稳定性

将提取物分别用1 mol/l 的HCl 或1 mol/l 的NaOH 调节pH 值至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0[6]，进行抑菌试验，测定不同pH值对提取物抑菌活性的影响。

1.4.4.2 大高良姜提取物热稳定性

将提取物分别置于60、70、80、90、100 ℃水浴保温30 min，进行抑菌试验，测定不同温度对提取物抑菌活性的影响。

1.4.4.3 大高良姜提取物紫外光照稳定性

将提取物置于超净工作台紫外灯下，分别照射10、20、30、40、50、60 min，进行抑菌试验，测定不同紫外光照射时间对提取物抑菌活性的影响。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂筛选

不同溶剂大高良姜提取物对各试验菌体外抑菌活性的影响结果见表2。由表2 可知，阳性对照抑菌圈的范围符合非苛养菌纸片扩散法质量控制允许范围（17～27 mm）[9]，表明本试验数据具有参考价值，而阴性对照均无抑菌圈产生。大高良姜的乙醇、石油醚、乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌和黑曲霉均有抑菌活性，对这两种菌抑制作用大小均为乙醇提取物＞石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物；乙醇、石油醚、乙酸乙酯提取物对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均没有抑制作用，这可能是由于不同微生物的细胞结构和代谢特征所造成的。水提取物仅对大肠杆菌有抑制作用且抑菌圈较小，推测大高良姜中主要的抑菌物质可能是脂溶性的。汪光华等[7]和程红党[11]的研究结果显示大高良姜的同属植物高良姜的提取物对黑曲霉没有抑菌活性，这与本试验结果不同，可能是由于大高良姜含有不同的抑菌物质所造成的。大高良姜的乙醇和石油醚提取物对金黄色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌活性接近，但石油醚极易挥发且具有一定毒性。综上所述，确定后续试验以金黄色葡萄球菌和黑曲霉为指示菌，以乙醇作为提取溶剂进行正交试验。

2.2 正交试验优化提取工艺

表2 提取溶剂对大高良姜提取物体外抑菌活性的影响

2.2.1 正交试验结果与分析

以乙醇浓度（A）、提取温度（B）、提取时间（C）和液料比（D）为考察因素，设置四因素三水平正交试验，优化大高良姜抑菌物质的提取工艺，正交试验设计及结果见表3。由表3 可知，以金黄色葡萄球菌为指示菌时，各因素对提取物抑菌活性的影响大小为A（乙醇浓度）＞C（提取时间）＞D（料液比）＞B（提取温度），最佳提取工艺组合为：A3B2C2D2。

以黑曲霉为指示菌时，各因素对大高良姜提取物抑菌活性影响差异较小，这可能是因为霉菌的菌丝体具有一定的蔓延性，导致抑菌圈边界不够清晰。其中料液比由1∶15 提高到1∶20，这两个水平下变化不明显，考虑到成本和环保等因素，最佳提取工艺调整为A3B2C2D2。

表3 L9(34)正交试验设计与结果

2.2.2 最佳提取工艺验证

按正交试验最佳工艺组合进行提取，测得提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为（25.02±1.56）mm，较优化前提高了38.6%；对黑曲霉的抑菌圈直径为（22.74±1.72）mm，较优化前提高了33.7%，表明优化后的工艺条件能较好地提取出大高良姜中的抑菌成分。

表4 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）试验

2.3 MIC和MBC的测定(见表4)

由表4可知，大高良姜提取物的浓度越高，其抑菌活性越强。大高良姜提取物对金黄色葡萄球菌和黑曲霉的MIC均为0.313 mg/ml，MBC分别为1.25 mg/ml和0.625 mg/ml，抑菌效果强于食品常用的防腐剂山梨酸钾、苯甲酸钠（对金黄色葡萄球菌的MIC 分别为2.5 mg/ml和25.0 mg/ml[8]）。

2.4 大高良姜提取物稳定性研究

表5 pH值对大高良姜提取物抑菌活性的影响

2.4.1 大高良姜提取物的pH值稳定性(见表5)

由表5可知，大高良姜提取物在pH值6.0时对金黄色葡萄球菌和黑曲霉均具有抑菌活性，当pH≤4.0或pH≥8.0时抑菌作用消失。当pH值逐渐升高时，提取物的颜色逐渐由黄色（pH 值8.0）变为褐色（pH 值10.0），甚至出现红棕色沉淀（pH 值12.0），与刘晓蓉等[12]观察到的现象类似，推测可能是提取物中含有较多的黄酮类化合物，其在碱性条件下不稳定，易发生结构变化导致颜色改变。

2.4.2 大高良姜提取物的热稳定性

温度对大高良姜提取物抑菌活性的影响见图1。由图1 可知，随着温度升高，大高良姜提取物的抑菌活性总体呈下降趋势。经60 ℃处理30 min 后，提取物的抑菌活性较未处理（以提取物制备时的提取温度55 °C计）前明显下降，这可能与其中某些抑菌物质对温度敏感有关[6]；相比60 ℃处理后的抑菌活性，提取物经70、80 ℃处理后抑菌活性有所提高，这可能是因为在该温度范围内某些成分的结构发生了变化或相互发生反应，生成了新的具有抑菌活性的物质；90 ℃处理组的抑菌活性急剧降低，这可能是由于某些具有抑菌活性的挥发油类物质在较高温度下易挥发所造成的[13]。

图1 温度对大高良姜提取物抑菌活性的影响

2.4.3 大高良姜提取物的紫外光照稳定性

紫外光照对大高良姜提取物抑菌活性的影响见图2。由图2可知，随着紫外光照射时间的延长，大高良姜提取物抑菌活性整体呈下降趋势，表明其中含有某些见光易分解的物质（如酚类）。对于黑曲霉，提取物照射30～50 min后，抑菌活性逐渐上升，这可能是由于提取物中某些成分经紫外光照射后生成了对霉菌有抑制作用的物质。

图2 紫外光照射时间对大高良姜提取物抑菌活性的影响

3 讨论

中草药具有绿色、安全、低残留、不易产生耐药性等优势，是一种前景良好的绿色饲料添加剂。

本文采用抑菌圈法测定大高良姜不同溶剂提取物对饲料微生物污染中常见的4种细菌和2种真菌的体外抑菌活性，确定了乙醇为最佳提取溶剂。以试验菌中抑菌活性较好的金黄色葡萄球菌和黑曲霉为指示菌，通过正交试验优化提取工艺；在最佳提取条件下所得的大高良姜提取物对金黄色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌圈分别为25.02 mm 和22.74 mm，优于阳性对照药物的抑菌效果，显示出良好的抑菌活性；最小抑菌浓度均为0.313 mg/ml，最小杀菌浓度分别为1.25 mg/ml 和0.625 mg/ml，具有作为一种绿色天然抑菌剂的潜力。目前，国内关于高良姜活性成分抑菌作用的文献较多，但对其同属植物大高良姜提取物抑菌活性的研究尚未见报道，本文为开发利用大高良姜资源和研究大高良姜的抑菌成分提供理论依据。