黑水虻幼虫处理豆粕、棉籽粕和菜籽粕对抗营养因子和小肽的影响

2020-04-08胡文锋李雪玲李楚君朱剑锋

饲料工业 2020年6期

■邓波胡文锋，* 李雪玲李楚君朱剑锋

（1.华南农业大学食品学院，广东广州510000；2.广州无两生物科技有限公司，广东广州510000；3.生物源生物技术（深圳）股份有限公司，广东深圳518000）

昆虫在过去几十年中受到广泛关注，被认为是潜在的可持续饲料原料来源[1]，是解决饲料蛋白质来源缺乏等相关的全球问题的潜在解决方案[2]。特别是黑水虻幼虫，在粮食和牲畜的大规模生产中有着巨大的潜力。与其他苍蝇如家蝇相比，黑水虻幼虫不是害虫，因为它们在成年阶段不进食。黑水虻幼虫是适应能力强大的生物，可以在各种环境中茁壮成长[3]。使用粪便养殖的黑水虻幼虫和蛹中含有丰富的必需氨基酸和矿物质，是家禽和牲畜饲料中适合的饲料原料，其营养价值可与鱼粉相媲美。现有文献表明，黑水虻幼虫作为饲料原料的商用替代品具有很大潜力[4]。许多研究强调有可能用黑水虻幼虫取代日益昂贵的饲料蛋白质来源。黑水虻幼虫蛋白质含量（37%～63%）和脂肪含量（高达49%）高，它所含有的一些宏观和微量营养素对人类健康和动物发育很重要[5]。研究还表明，黑水虻具有特定的抗菌特性，有可能作为饲料添加剂在饲料工业中应用[6]。黑水虻幼虫对黄曲霉毒素B1、霉菌毒素和杀虫剂等毒素也具有一定的降解能力。与肉类相比，昆虫被认为是最佳的蛋白质来源，因为它对环境的影响较小。黑水虻幼虫生命循环周期评估表明：与其他动物相比，黑水虻幼虫对环境的影响较小[7]。人们对黑水虻作为陆生动物和水生动物饲料的兴趣逐年增长，越来越多的科学研究集中在这一主题上[8]。同时，黑水虻幼虫被认为是用于动物饲料的重要候选物种，自20 世纪70 年代以来，该物种一直被用作动物饲料中的蛋白质来源，这主要是因为它能够以食物废弃物为食后，其幼虫和蛹含有高质量的蛋白质[9]。在一些鱼类饲料中成功地用黑水虻幼虫替代鱼粉，并且其对鱼类的生长性能没有负面影响。

毛银等[10]通过试验，用一种高酸产量的乳酸菌DY6 作为发酵菌株，与未发酵豆粕相比，发酵豆粕中的粗蛋白含量增加6.23%，多肽含量增加223%，总酸含量增加1.8%，蛋白质体外消化率增加17.85%。根据杨玉娟等[11]的调查分析：大豆球蛋白发酵后平均下降57.7%，胰蛋白酶抑制剂含量下降59.1%，β-伴大豆球蛋白含量下降63.2%，水苏糖含量下降82.5%。魏春等[12]用乳酸菌发酵棉粕48 h 后，游离棉酚的降解率达到73.44%。史玉宁等[13]使用曲霉菌和酵母菌对豆粕进行复合固体有氧发酵，发酵7 d 后，发酵组中粗蛋白、粗脂肪含量分别增加5.6%和6.2%，而必需氨基酸和总氨基酸含量相对未发酵对照组分别增加了3.55%和8.14%。陆豫等[14]利用黑曲霉菌、植物乳酸杆菌和酿酒酵母菌一起发酵菜籽粕，发现单宁的降解率达到94.38%。马文强等[15]利用乳酸杆菌发酵豆粕，发酵后硫代葡萄糖苷降解了30.73%，粗蛋白含量从38.41%提高到45.44%，多肽含量从0.8%提高到2.62%。使用发酵处理饼粕原料是当前研究的热门，但是由于目前人们对微生物知识和发酵工艺了解不是很深刻，缺乏对原料的筛选评测，这些因素都影响着生物发酵饲料的质量稳定和安全。

本文对三种主要的饼粕和十余种抗营养因子进行了测试和分析，研究黑水虻幼虫处理饼粕原料作为饲料生产新工艺的可行性，同时，为了减少对发酵工艺优化的依赖性，研究中并未对发酵条件(温度、发酵时间、水分等)进行优化。

1 材料和方法

1.1 试验设计和操作

①对空白饼粕组中抗营养因子和小肽的含量进行了测量。②将菌粉（0.25 g）加入饼粕中进行发酵(50 g饼粕和50 ml水混合，在27 ℃条件下发酵10 d)，测定发酵饼粕中的小肽和抗营养因子的含量。③将黑水虻幼虫(50、100只和200只)分别添加到空白饼粕中(50 g空白饼粕和50 ml水混合，在27 ℃条件下喂养10 d)，然后测量和记录数据（小肽和抗营养因子的含量）。④将黑水虻幼虫(50、100 只和200 只)分别添加到发酵饼粕中(50 g发酵饼粕和50 ml水混合，在27 ℃条件下喂养10 d)。⑤利用Spss Statistics 对数据进行单因素方差分析。具体的试验设计见表1。

表1 试验设计

1.2 黑水虻幼虫

黑水虻幼虫由华南农业大学提供，3 g 黑水虻幼虫卵放入试管中，并在室温下孵育3 d，获得黑水虻幼虫。幼虫孵育期间不需要喂食，因为它们在不进食的情况下可存活5 d。

1.3 饼粕

豆粕由生物源生物技术(深圳)股份有限公司提供，由中国南京市丽水区生产。棉籽粕购自石家庄市嘉惠街道的嘉惠饲料公司。菜籽粕购自江苏省南京市欣悦农家油坊。饼粕在使用前要捣碎，并用搅拌机搅碎，装入包装袋放入阴凉干燥处保存。

1.4 菌粉和培养

菌粉（由酵母菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌组成，按照1∶0.5∶1.5比例混合而成）提供，由生物源生物技术(深圳)股份有限公司提供。实验场所为华南农业大学食品学院应用微生物实验室。

1.5 化学分析

1.5.1 植酸

根据国家标准测定豆粕、菜籽粕、棉籽粕中的植酶含量（GB/T 18634—2009）。

1.5.2 单宁棉籽粕和菜籽粕中单宁的含量根据国家标准测量（GB/T 27985—2011）。

1.5.3 游离棉酚

根据国家标准方法（GB/T 27985—2011）,测定棉籽粕中游离酚的含量。

1.5.4 粗蛋白和小肽

根据国家标准方法测定豆粕、菜籽粕和棉籽粕中粗蛋白的含量（GB/T 6432—2018）。根据考马斯亮蓝试剂盒测定豆粕、棉籽粕和菜籽粕中小肽的总含量。试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.5.5 胰蛋白酶抑制剂和β-伴大豆球蛋白

根据国家标准方法测量豆粕中胰蛋白酶抑制剂的活性（GB 5009.224—2016）。根据ELISA 试验试剂盒测定豆粕中β-伴大豆球蛋白的含量。试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.5.6 总戊聚糖和可溶性戊聚糖

根据我国农业标准（NY/T 2335—2013）测量豆粕中戊聚糖和可溶性戊聚糖的含量。

1.6 统计分析

通过Spss Statist ics 22.0 软件对数据进行单因素方差分析。同时，通过多重比较重点显示了添加黑水虻幼虫的空白组和添加了黑水虻幼虫的发酵组之间的差异。P＜0.05 被认为是显著性差异。所有的数据都是经过三次试验所取的平均值。

2 结果

2.1 豆粕的重量、小肽以及抗营养因子的变化

2.1.1 豆粕中小肽和抗营养因子含量的变化(见表2)

表2 不同处理方法对豆粕中小肽和抗营养因子含量的影响

如表2所示，对比空白豆粕组，S2和S3(S3-50、S3-100 和S3-200)中脲酶的降解率分别为63%和22%、33%、60%；同时，S4(S4-50、S4-100 和S4-200)中脲酶的降解率分别达到48%、52%和85%。总体而言，豆粕中脲酶的活性随着黑水虻幼虫数量的增加而降低。

与空白组相比，在S2、S3-50和S3-100中β-伴大豆球蛋白的降解率分别为18%、40%和9%(表2)。S4中β-伴大豆球蛋白的降解率分别为70%、69%和59%。显然，随着黑水虻数量的增加，豆粕中β-伴大豆球蛋白的含量不断上升。

S2 中粗蛋白含量相对于空白豆粕组下降了19%。而S3 粗蛋白的含量只有25.9%、27.12%和31.25%。S4 中粗蛋白含量分别为32.76%、39.35%和42.87%。这表明，用黑水虻处理豆粕，不能增加空白豆粕组中粗蛋白的含量，但可以增加发酵豆粕中粗蛋白的含量。

通过单因素多重比较S2、S3-200和S4-200可知，它们之间所含的小肽、粗蛋白、β-伴大豆球蛋白、可溶性戊聚糖和植酸含量差异性显著(P＜0.05)。值得注意的是，S2和S3-200的胰蛋白酶抑制因子差异性并不显著(P＞0.05)，这说明黑水虻幼虫对于处理空白豆粕组的胰蛋白酶抑制因子的效果并不明显，但是随着黑水虻幼虫数量的增加，胰蛋白酶抑制因子的含量是不断降低的。

2.1.2 黑水虻幼虫处理豆粕后样品的重量变化(见图1)

图1 黑水虻处理豆粕前后其重量的变化

如图1 所示，使用黑水虻幼虫处理豆粕后，样品的重量没有显著变化(平均减少了0.81 g/50 g)。因此，利用黑水虻处理豆粕是一种可行的方法，因为这不会影响饲料生产的成本，造成豆粕原料的损失。

2.2 棉籽粕的重量、小肽以及抗营养因子的变化

2.2.1 棉籽粕中小肽和抗营养因子含量的变化(见表3)

表3 不同处理方法对棉籽粕中小肽和抗营养因子含量的影响

如表3 所示，相对于空白棉籽粕组，P2 和P3(P3-50、P3-100 和P3-200）中单宁的降解率分别达到了39%和33%、42%、43%；同时，P4（P4-50、P4-100 和P4-200）中单宁的降解率分别达到21%、26%和30%。

与P1 相比，P2 中粗蛋白含量下降了26%，而P3-100 和P3-200 中粗蛋白的含量分别增加6%和8%。与P1相比，P4中粗蛋白的含量分别增加了3%、6%和11%。结果表明，用黑水虻处理菜籽粕可以显著增加其粗蛋白的含量，并且随着黑水虻幼虫数量的增加，样品中粗蛋白的含量也不断上升。根据T1、T2和T3多重比较可知，总体来看，这三组中所含的小肽和抗营养因子含量差异显著(P＜0.05)，只有T1中的单宁的差异性为0.15(P＞0.05)，这说明黑水虻幼虫对于空白棉籽粕中的单宁降解能力并不有效，但这与黑水虻幼虫的数量密切相关，如表3所示，随着黑水虻幼虫数量的增加，棉籽粕中单宁的含量不断下降。

2.2.2 黑水虻幼虫处理棉籽粕后样品的重量变化（见图2）

图2 黑水虻处理棉籽粕前后其重量的变化

如图2 所示，整体上看，用黑水虻幼虫处理棉籽粕后其重量都有不同程度的减少，平均减少了1.5 g/50 g。由此可得：利用黑水虻幼虫处理棉籽粕不会对棉籽粕饲料的生产造成影响。

2.3 菜籽粕的重量、小肽和抗营养因子含量的变化

2.3.1 菜籽粕中小肽和抗营养因子含量的变化(见表4)

如表4 所示，相对于空白菜籽粕组，D2 中单宁的降解率为40%，而D3（D3-50、D3-100和D3-200）中单宁的降解率分别为41%、43%和48%。与D1相比，D4（D4-50、D4-100 和D4-200）中单宁的降解率分别为43%、45%和50%。这表明单宁的降解率随着黑水虻幼虫数量的增加而升高。

与D1 相比，发酵菜籽粕中粗蛋白的含量增加13%，D3（D3-50、D3-100 和D3-200）和D4（D4-50、D4-100 和D4-200）中粗蛋白含量分别为29.4%、31.6%、33.6%和23.3%、31.47%、34.7%。

通过对G1、G2 和G3 进行多重比较可得，从总体来看，利用黑水虻幼虫处理菜籽粕后各组中所含的小肽和抗营养因子含量都有显著性变化(P＜0.05)，只是G3 中单宁、噁唑烷硫酮和植酸的含量却没有明显的差异(P＞0.05)，这说明在利用黑水虻幼虫处理菜籽粕时，无论菜籽粕是否经过发酵，都不会影响对其单宁、植酸和噁唑烷硫酮的降解效果。

2.3.2 黑水虻幼虫处理菜籽粕后样品的重量变化（见图3）

表4 不同处理方法对菜籽粕中小肽和抗营养因子含量的影响

如图3 所示，菜籽粕经过黑水虻幼虫处理后其重量都有不同程度的减少，平均下降了3.8 g/50 g。这说明了黑水虻处理菜籽粕对其重量的影响具有不稳定性，特别是菜籽粕经过黑水虻幼虫处理后，其重量的减少量远远高于豆粕(0.81 g/50 g)和棉籽粕(1.5 g/50 g)，因此，黑水虻幼虫处理菜籽粕并不适合大规模的饲料生产，因为这会造成菜籽粕原料的损失。

图3 黑水虻处理菜籽粕前后其重量的变化

3 讨论

使用黑水虻幼虫处理发酵饼粕可大大提高其小肽的含量。李永凯等[16]将豆粕用枯草芽孢杆菌发酵处理后其小肽的含量增加4.35%。本研究中，与S1(表2)相比，S4 中小肽的含量分别增长366%、462%和657%。这些比文献中所描述的含量高得多。艾庆辉等[17]发现在发酵棉籽粕和发酵酶水解产品中，小肽的含量分别提高到19.41%和23.59%。夏尚培[18]利用酵母菌Y-619 发酵使棉籽粕中小肽的含量增加了10.93%。本研究中(表3)，P4-200 中小肽的含量相比空白棉籽粕组增加了630%。陈娟等[19]发酵菜籽粕后，其小肽的含量增加了18.36%。在我们的研究中，与D1(表4)相比，D4中小肽的含量分别增加了320%、408%和468%，这与豆粕和棉籽粕的研究基本相符。结果表明，用黑水虻幼虫处理的发酵豆粕、棉籽粕和菜籽粕其小肽的含量明显高于发酵饼粕。原因可能是黑水虻幼虫中存在丰富的小肽，或者黑水虻幼虫可以将饼粕中的氨基酸转化为小肽。

用黑水虻幼虫处理豆粕后其胰蛋白酶抑制剂的含量明显下降。余冰等[20]测得豆粕和发酵豆粕中胰蛋白酶抑制剂的平均含量分别为18.4 mg/g 和7.5 mg/g，发酵后胰蛋白酶抑制剂的含量下降了59.1%。王芳等[21]对豆粕进行发酵后其胰蛋白酶抑制剂的含量减少77.8%。刘萍等[22]发酵豆粕后其胰蛋白酶抑制剂的降解率达到了57.24%。本研究与S1 相比，S3-200 中豆粕的胰蛋白酶抑制因子的降解率达到44%(表2),这低于文献中描述的水平，但豆粕胰蛋白酶抑制因子的降解率在S4-200 中达到了63%(表2)，这是添加了黑水虻幼虫的结果。此外，随着黑水虻幼虫数量的增加，豆粕中胰蛋白酶抑制因子的降解率呈上升趋势。原因可能是黑水虻幼虫可以分散形成胰蛋白酶抑制因子的蛋白质，防止其各种蛋白质形成混合物，从而减少胰蛋白酶抑制因子的含量。

本试验研究表明，用黑水虻幼虫处理饼粕对其植酸有明显的降解作用。李莉娜等[23]用混合的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和植物乳酸杆菌发酵菜籽粕后，其植酸的降解率达到了18.5%。在本试验中，S3-200、P3-200 和D3-200（表2、表3 和表4）中植酸的降解率最高分别为37%、79%和97%。而在S4-200、P4-200和D4-200中植酸的降解率最高分别达到了63%、87%和98%（表2、表3和表4）。这些降解率明显高于其他文献中描述的，而且，随着黑水虻幼虫数量的增加，饼粕的降解率持续增加。其原因可能是用黑水虻幼虫处理饼粕时，可以帮助饼粕从植酸盐中提取磷、钙、镁等矿物质元素，减少植酸的形成，从而降低植酸含量。

随着棉籽粕中黑水虻幼虫的增加，其游离棉酚的降解率也不断升高。亓秀晔等[24]用枯草芽孢杆菌发酵棉籽粕，发现游离棉酚的降解率达到了93.89%。卜小丽等[25]采用生物和物理方法处理棉籽粕，结果发现棉籽粕中游离棉酚的降解率可达90.57%。肖永友等[26]利用酵母菌Y-619 发酵棉籽粕后发现游离棉酚的降解率达到76.24%。在本文研究中，P4 中游离棉酚的降解率分别为3%、46%和81%(表3)，虽然降解率低于其他文献中描述的，但其降解率会随着黑水虻幼虫数量的增加而上升。其原因可能是黑水虻幼虫可以破坏醛基组、羟基组，并钝化其自由棉酚的化学特性。

黑水虻幼虫对菜籽粕中的噁唑烷硫酮有明显的降解作用。梁伟秋等[27]利用植物乳酸菌和曲霉菌发酵菜籽粕后其噁唑烷硫酮的降解率可达81.82%。傲维平等[28]利用混合菌株发酵后发现其噁唑烷硫酮的降解率为99.99%。这与我们的研究一致，即D4-200 的降解率为99%(表4)。其原因可能是在利用黑水虻幼虫处理菜籽粕和发酵菜籽粕的过程中，降低了其甲酰胺酶的含量，从而减少了噁唑烷硫酮的形成。

通过单因素方差分析，黑水虻幼虫处理豆粕对其总戊聚糖和可溶性戊聚糖的含量没有显著影响(P＞0.05)(表2)。相反，黑水虻幼虫对豆粕中小肽和胰蛋白酶抑制因子的含量影响最大（P＜0.05），同时，小肽和胰蛋白酶抑制因子的标准差为427和87(表2)，这明显高于其他组的标准差。在用黑水虻幼虫处理棉籽粕后，其抗营养因子和小肽的含量发生了显著改变（P＜0.05）,尤其是小肽和游离棉酚变化最大，其标准偏差分别高达18.48和260(表3)。同样，菜籽粕中小肽的含量也有显著变化(P＜0.05)，其标准偏差高达19(表4)。