健脾疏肝降脂方干预非酒精性脂肪肝病肥胖小鼠肝功能、游离脂肪酸机制探讨*

巴明玉，娄永强，禄保平

1.河南中医药大学第一附属医院(郑州450000)；2.河南省通许县中医院(通许 475400)； 3.河南中医药大学(郑州 450046)

非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)在一定程度上是可逆的，肥胖病患者在进行减肥手术后肝脂肪变能够得到好转，由此可见，肥胖与非酒精性脂肪肝病的发病关系密切[1-2]。导师禄保平教授从中医基本理论入手，结合历代医家的临证经验，总结出的健脾疏肝降脂方治疗非酒精性脂肪肝效果显著。现笔者就此方对NAFLD肥胖小鼠ALT、AST、游离脂肪酸(Free fatty acid，FFA)及光镜下病理组织学的影响作一实验研究，现报告如下。

材料与方法

1 药 物 健脾疏肝降脂方购买及鉴定均符合国家《中国药典》标准按要求配制成相应浓度药液。药物对照组所用壳脂胶囊(批号：Z20050665)，配成混悬液备用；四氯化碳：济宁恒泰化工有限公司(批号：20130904)；0.9%氯化钠注射液：广州市昕迪实验器材有限公司(批号：20140614)；5%的CCl4食用油溶液：(四氯化碳∶玉米油=5∶95，V/V)混合液。

2 试剂和仪器 游离脂肪酸(FFA)试剂盒(批号：20140617)、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒(批号：20140817)、谷草转氨酶(AST)试剂盒(批号：20140817)均有青岛雅各化学试剂销售有限公司提供；全自动生化分析仪、CX31-32C02光学显微镜(日本OLYMPUS株式会社)；石蜡切片机、LEICA切片机、摊片机、烘片机(德国莱卡公司)；伯乐680全自动酶标仪(北京伯乐生命科学发展有限公司)。

3 动物分组 健康SPF级小鼠72只，随机分为空白组，模型对照组，壳脂胶囊组，健脾疏肝降脂方高、中、低剂量组。除空白组外，其余各组均以髙脂饲料(79.8%基础饲料、18%猪油、2%胆固醇和0.2%的丙基硫氧嘧啶)喂养6周，6周后除空白组外，其余各组均用CCl4注射法建立非酒精性脂肪肝模型。实验方法参照《药理实验方法学》[3]。

4 给药方法及途径 壳脂胶囊组按0.5 g/(kg·d)壳脂胶囊药液；健脾舒肝降脂方高、中、低剂量组分别给予80、40、20 g/(kg·d)健脾舒肝降脂方药液[4]；空白组及模型组均给予等容量的生理盐水灌胃。每天1次，连续灌胃6周，每周测量小鼠体重并记录。

5 一般指标测定 实验6周末，最后1次给药后对小鼠禁饮食及水12 h后，采血测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)，并采取肝组织匀浆检测游离脂肪酸(FFA)。

6 光镜观察 小鼠处死后，迅即剖腹取出肝脏，新鲜肝脏组织用4%的多聚甲醛溶液固定常规石蜡包埋切片，常规脱蜡及脱水，常规石蜡包埋、切片，然后进行HE染色，梯度酒精脱水，中性树胶封片，放置1周，待胶片干后光镜下观察肝组织的脂肪变程度。

结 果

1 健脾疏肝降脂方对小鼠肝功能的影响 药物干预6周后，中药各个浓度组相比壳脂胶囊组更能明显降低血清 ALT、AST，有统计学意义(P<0.05)；其药物治疗组与模型组相比均可以明显降低血清 ALT、AST，有统计学意义。见表1。

表1 药物对各组小鼠血清ALT、AST 水平的影响(U/L)

注：与空白组相比，△P<0.05，*P<0.01；与模型组相比，#P<0.01

2 健脾疏肝降脂方对小鼠肝组织FFA的影响 药物干预6周后，治疗高、中剂量组 FFA 降低，与模型组相比有统计学意义；但高、中剂量组相比壳脂胶囊组效果相当，差异无统计学意义。由此可以看出，在降低FFA方面，高、中剂量组效果较好。见表2。

表2 药物对各组小鼠肝组织 FFA 的影响(μmol/gprot)

注： 与正常组相比，△P<0.05；与模型组相比，▲P<0.05

3 光镜下肝组织病理组织学观察 空白组：镜下见细胞结构正常，肝小叶结构清晰，排列均匀；无脂肪变性及坏死，未见炎性细胞浸润。模型对照组小鼠的肝小叶结构不清晰，可见肝组织呈弥漫性脂肪变性，细胞内单个大脂滴将细胞核挤向细胞膜，有时可见由2个及2个以上的破裂肝细胞融合，呈“气球样”改变。各用药组小鼠的肝小叶脂肪变肝细胞数目均减少。用药组中、高剂量组相对低剂量组及壳脂胶囊组细胞内胞浆丰富，胞质内脂滴减少或消失，细胞核大小正常，位置居中，肝细胞脂肪变性程度得到很大改善。

讨 论

ALT、AST属于肝细胞合成的常见酶之一，可有效维持机体正常的生理活动，是机体进行物质代谢的必要物质之一，有研究证实，肝脏中含有大量的酶，但当肝功能出现异常情况时，肝细胞的细胞通透性出现不同程度的改变，易导致酶从肝细胞内大量释放至血液中，引起血清相关酶水平出现不同程度的变化，因此，可将血清酶水平作为评价肝细胞受损的有效指标之一，而ALT、AST具有较高的敏感性和特异性，所以可将其作为诊断、评估脂肪肝的指标之一[5]。另外脂代谢紊乱及胰岛素抵抗(IR)也是NAFLD的主要致病机制之一，脂质沉积，即肝脏获取的游离脂肪酸(Free fatty acid，FFA)超过肝脏自身处理能力(β氧化能力)，导致甘油三酯淤积[6]。游离脂肪酸对非酒精性脂肪肝影响是多重的，同脂肪变性、肝组织炎症以及其纤维化等病变相关[7]。FFA过高可启动氧化应激机制，激活多种信号通路导致IR，IR又可降低胰岛素抑制脂肪酶的活性，使外周组织脂肪分解增多，FFA水平增高[8]。而血清中FFA过多，被肝细胞大量摄取后将导致肝细胞脂肪变性，形成NAFLD[9]。因此，检测血清中AST、ALT含量及游离脂肪酸水平可以作为评价药物治疗非酒精性脂肪肝的重要参考依据。

肥胖合并NAFLD多因平素嗜食肥甘之品，脾失健运，痰浊内生，血脉瘀滞，痰瘀互相搏结而形成，病机为本虚标实，本虚以脾为主，标实主要为痰湿、血瘀；脾气虚津液不能四布，则津液不足；脾虚不能运化水谷精微，则生痰湿，阻滞气机成瘀。结合其病机特点，导师禄保平教授通过中医辨证结合临床经验自拟了健脾疏肝降脂方(由党参、茯苓、白术、橘红、柴胡、郁金、虎杖、荷叶、决明子、山楂、炙甘草等药物组成)，临床已取得显著的治疗效果。现代药理研究表明，党参、白术、茯苓均有护肝、保护肝功能的作用[10-12]。本方中山楂、荷叶、决明子临床应用及现代研究都有很好的降脂减重作用[13-15]。综观全方，补中兼泄，体现了健脾不忘疏肝，扶正不忘祛湿的原则，共达肝体得养，肝用得畅，邪去正安的目的，因此本方充分体现了中医辨证论治的基本理论与现代研究的完美结合。

经过6周治疗，药物治疗组均可以明显降低血清ALT、AST，中药各个浓度组相比壳脂胶囊组更能明显降低血清ALT、AST，有统计学意义；由此可以看出此方在降低小鼠血清ALT、AST方面与药物剂量无明显关系；但此方在改善FFA方面，高、中剂量组相比壳脂胶囊组效果相当，差异无统计学意义。结合病理学观察显示，相对于低剂量组及壳脂胶囊组，健脾疏肝降脂方中、高剂量组细胞内胞浆丰富，胞质内脂滴减少或消失，细胞核大小正常，位置居中，肝细胞脂肪变性程度得到很大改善。由此可以看出，健脾疏肝降脂方可以明显改善NAFLD肥胖小鼠的肝功能、FFA，并且病理结果也支持其效果与药物浓度存在关系。