齐墩果酸硫脲类衍生物的合成及以VEGFR-2为靶点的分子对接研究

李 杰，宋艳玲

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

齐墩果酸(oleanolic acid，OA.结构式如图1所示)是一种重要的五环三萜类化合物，可以通过女贞子、苹果皮、橄榄叶和丁香花等植物中提取得到[1-2].齐墩果酸及其衍生物具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、降血糖、抗炎、抗菌、抗氧化等[3-8].但齐墩果酸水溶性差，生物利用度低[9]，限制了其临床应用.硫脲类化合物是目前最具前景的抗癌制剂，研究表明其对肺癌、乳腺癌、肉瘤等多种肿瘤具有抑制作用[10-12].齐墩果酸C-3或C-28链的延长能够增加其抗肿瘤活性[3].根据活性叠加原理，将硫脲片段引入齐墩果酸C-3位，以期提高化合物抗肿瘤活性.

图1 齐墩果酸结构式Fig.1 Chemical structures of OA

计算机辅助药物设计(computer-aided drug design，CADD)因其准确的信息成为新药研究和药物设计方面的重要工具[13].分子对接(molecular docking)是通过研究小分子配体与受体生物大分子相互作用，将配体分子置于受体分子的活性位点，利用化合物与受体蛋白的三维结构进行对接，预测化合物的生物活性.VEGFR是一类酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，属于受体型蛋白酪氨酸激酶，VEGFR-2在与肿瘤相关的血管生成中发挥重要作用，是诱导血管生成和增加血管渗透性的主要受体[14].以VEGFR-2为靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂已成为目前研究热点，如已上市药物舒尼替尼和索拉菲尼等[15-16].本文通过计算机辅助设计方法研究齐墩果酸衍生物与VEGFR-2靶蛋白分子对接，预测目标化合物抑制VEGFR-2 的活性.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker ARX-600型核磁共振仪，美国Bruker公司； Agilent 1100 SL离子阱质谱仪，美国安捷伦公司；Büchi B-540熔点测定仪，瑞士Büchi公司；薄层色谱(GF-254)、柱色谱硅胶(200-300目)，青岛海洋化工有限公司.

齐墩果酸(质量分数98 %)，陕西慈缘生物技术有限公司；芳香胺类药品，国药集团化学试剂有限公司；其他溶剂和药品均为市售分析纯.

1.2 合成实验

齐墩果酸衍生物的合成路线如下所示.

1.2.1 齐墩果酸甲酯(化合物1)的制备

将齐墩果酸OA(5.00 g，10.94 mmol)和无水K2CO3(3.78 g，27.35 mmol)溶于50 mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌下缓慢滴加碘甲烷(1.37 mL，21.89 mmol)，室温下继续搅拌反应6 h，TLC监测反应.反应结束后加水稀释，乙酸乙酯萃取，饱和NaCl溶液洗涤，水洗，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸干溶剂，得白色固体，干燥过夜.甲醇重结晶得白色针状晶体化合物齐墩果酸甲酯4.40 g，产率85 %，mp：196～198.8 ℃(文献mp：197～198.2 ℃)[17].

1.2.2 3-羰基-齐墩果酸甲酯(化合物2)的制备

将齐墩果酸甲酯(4.40 g，9.35 mmol)溶于100 mL丙酮中，冰浴下缓慢滴加琼斯试剂(11.5 mL)，直至反应液橘红色不再消失，滴毕，室温下反应1～2 h，TLC监测反应.反应完毕，加入130 mL异丙醇淬灭.反应结束后，减压蒸除部分溶剂，乙酸乙酯萃取，饱和NaCl溶液洗涤，水洗，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸干，得淡黄绿色固体，干燥，甲醇重结晶得白色晶体化合物3-羟肟基-齐墩果酸甲酯4.15 g，产率95 %，mp：186～187 ℃(文献mp：185～186 ℃)[18].

1.2.3 3-羟肟基-齐墩果酸甲酯(化合物3)的制备

将3-羰基-齐墩果酸甲酯(4.15 g，8.87 mmol)溶于50 mL吡啶中，加入盐酸羟胺(2.76 g，39.74 mmol)，50 ℃下反应2 h，TLC监测反应.反应结束后加入适量二氯甲烷稀释，质量分数10 %盐酸洗涤3次，饱和NaCl溶液洗涤，水洗，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸干，得白色固体化合物3-羟肟基-齐墩果酸甲酯3.24 g，产率75.5 %，mp：244～246 ℃(文献mp：247～249 ℃)[18].

1.2.4 3-氨基-齐墩果酸甲酯(化合物4)的制备

将3-羟肟基-齐墩果酸甲酯(4.88 g，10.10 mmol)溶于100 mL甲醇中，加入乙酸铵(9.04 g，117.30 mmol)，再加入NaBH3CN(7.08 g，112.70 mmol)，充分搅拌溶解，冰浴下缓慢滴加质量分数15 %的三氯化钛溶液(29.33 mL，34.22 mmol)，室温下反应12 h，TLC监测反应.反应结束后，蒸除部分溶剂，用体积分数为2 %的NaOH溶液调节pH至10，二氯甲烷萃取，蒸馏水洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸干，硅胶柱层析分离(200～300目)，洗脱剂：甲醇/二氯甲烷(体积比1∶20)，得白色固体化合物3-氨基-齐墩果酸甲酯3.78 g，产率80 %，mp：221.3～223.7 ℃.ESI-MS，m/z:470.8[M+H]+.1H NMR(600 MHz，CDCl3),δ:5.29(1H，s，H-12)，3.64(3H，s，H-31，—COOCH3)，3.21(s，2H，H-3，—NH2)，2.87(1H，d，J=13.6 Hz，H-3)，1.85(s，2H，H-2)，1.14(3H，s，Me)，1.02(3H，s，Me)，0.94(3H，s，Me)，0.91(6H，s，Me)，0.81(3H，s，Me)，0.74(3H，s，Me).13C NMR(600 MHz，CDCl3),δ:178.32(C-28)，143.77(C-13)，122.37(C-12)，60.05(C-3)，55.77(C-31)，51.54，47.66，46.74，45.87，41.66，41.30，39.22，38.84，37.67，37.13，33.86，33.12，32.68，32.39，30.70，29.71，28.47，27.69，25.93，23.65，23.35，23.08，18.59，16.85，15.97，15.20.

1.2.5 化合物Ⅰ1～Ⅰ6的制备

1.2.5.1 化合物Ⅰ1的制备

将3，4-二氯苯胺(0.155 3 g，0.958 7 mmol)加入盛有5 mL甲苯溶液的25 mL反应瓶中，60 ℃，油浴条件下搅拌，再逐滴滴加硫光气(0.073 4 g，0.639 1 mmol).滴加过程中看到反应液变浑浊，有橙黄色絮状物产生，并产生白烟.3 h后，将反应液抽滤，滤去絮状物，再将溶液进行减压旋蒸.将化合物4(0.300 2 g，0.639 1 mmol)用5 mL甲苯溶液完全溶解后加入上述浓缩的反应瓶中，反应液颜色为淡黄色，溶液澄清，常温反应0.5 h,TLC监测反应全过程，展开剂：V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=5∶1，显色剂：H2SO4-EtOH溶液.反应完成后，用配置好的饱和NaOH溶液将反应液洗3次取上层溶液，乙酸乙酯萃取(100 mL)3次，饱和食盐水冲洗3次，合并有机相，无水Na2SO4干燥过夜，静置，抽滤，洗涤，旋蒸除去溶剂，50 ℃真空干燥过夜，最终得淡黄色固体物质，用硅胶柱色谱分离，V(PE)/V(EA)=8/1洗脱，得化合物Ⅰ1白色粉末0.146 g，产率73 %，mp 199.0～201.0 ℃.1H NMR(600 MHz，DMSO),δ:9.72(s，1H，—NH)，8.11(s，1H，—NH)，7.57(d，J=9.0 Hz，1H，Ar—H5)，7.52(d，J=8.7 Hz，1H，Ar—H6)，7.39(d，J=7.4 Hz，1H，Ar—H2)，5.19(s，1H，H-12)，3.54(s，3H，H-31，—COOCH3)，2.78(d，J=13.6 Hz，1H，H-3)，1.83(s，2H，H-2，—CH2)，1.12(s，3H，Me)，0.88(d，J=5.7 Hz，12H，Me)，0.82(s，3H，Me)，0.67(s，3H，Me).

1.2.5.2 化合物Ⅰ2的制备

按照化合物Ⅰ1的合成方法，2-氟-4-甲基苯胺(0.139 5 g，0.958 7 mmol)与化合物4(0.301 2 g，0.639 1 mmol)反应，得化合物Ⅰ2淡黄色粉末0.128 g，产率64 %，mp:208.7～210.6 ℃.1H NMR(600 MHz，DMSO),δ:9.15(s，1H，—NH)，7.70(t，J=8.2 Hz，1H，Ar—H5)，7.44(d，J=9.0 Hz，1H，Ar—H3)，7.05(d，J=11.4 Hz，1H，—NH)，6.94(d，J=7.9 Hz，1H，Ar—H6)，5.19(s，1H，H-12)，3.54(s，3H，H-31，—COOCH3)，2.78(d，J=10.1 Hz，1H，H-3)，1.83(s，2H，H-2，—CH2)，1.12(s，3H，Me)，0.88(d，J=3.0 Hz，12H，Me)，0.78(s，3H，Me)，0.66(s，3H，Me).

1.2.5.3 化合物Ⅰ3的制备

按照化合物Ⅰ1的合成方法，邻氨基三氟甲苯(0.154 4 g，0.958 7 mmol)与化合物4(0.300 7 g，0.639 1 mmol)反应，得化合物Ⅰ3微黄色粉末0.156 g，产率78 %，mp:179.7～180.9 ℃.1H NMR(600 MHz，DMSO),δ:9.01(s，1H，—NH)，7.73～7.66(m，2H，Ar—H3、6)，7.61(d，J=7.8 Hz，2H，Ar—H4、5)，7.41(d，J=6.7 Hz，1H，—NH)，5.20(s，1H，H-12) 3.54(s，3H，H-31，—COOCH3)，2.78(d，J=12.2 Hz，1H，H-3)，1.83(s，2H，H-2，—CH2)，0.89(d，J=12.5 Hz，15H，Me)，0.81(s，3H Me，)，0.67(s，3H，Me).

1.2.5.4 化合物Ⅰ4的制备

按照化合物Ⅰ1的合成方法，2-氟苯胺(0.106 5 g，0.958 7 mmol)与化合物4(0.301 5 g，0.639 1 mmol)反应，得化合物Ⅰ4白色粉末0.162 g，产率81 %，mp:204.8～206.7 ℃.1H NMR(600 MHz，DMSO),δ:9.26(s，1H，—NH)，7.97(t，J=7.4 Hz，1H，Ar—H3)，7.60(d，J=9.1 Hz，1H，Ar—H6)，7.25～7.19(m，1H，—NH)，7.13(dd，J=13.8、6.0 Hz，2H，Ar—H4，5)，5.20(s，1H，H-12)，3.54(s，3H，H-31，—COOCH3)，2.78(dd，J=13.7、3.8 Hz，1H，H-3)，1.83(s，2H，H-2，—CH2)，1.13(s，3H，Me)，0.88(d，J=3.9 Hz，12H，Me)，0.80(s，3H，Me)，0.67(s，3H，Me).

1.2.5.5 化合物Ⅰ5的制备

按照化合物Ⅰ1的合成方法，3-氟苯胺(0.110 5 g，0.958 7 mmol)与化合物4(0.301 2 g，0.639 1 mmol)反应，得化合物Ⅰ5白色粉末0.124 g，产率62 %，mp:187.9～190.0 ℃.1H NMR(600 MHz，DMSO),δ:9.69(s，1H，—NH)，7.78(d，J=11.5 Hz，1H，—NH)，7.48(d，J=9.1 Hz，1H，Ar—H4)，7.34～7.27(m，1H，Ar—H2)，7.18(d，J=7.8 Hz，1H，Ar—H6)，6.86(s，1H，Ar—H5)，5.20(s，1H，H-12)，3.54(s，3H，H-31，—COOCH3)，2.78(d，J=10.4 Hz，1H，H-3)，1.83(s，2H，H-2，—CH2)，0.88(d，J=4.9 Hz，15H，Me)，0.82(s，3H，Me)，0.67(s，3H，Me).

1.2.5.6 化合物Ⅰ6的制备

按照化合物Ⅰ1的合成方法，4-氟苯胺(0.118 9 g，0.958 7 mmol)与化合物4(0.301 2 g，0.639 1 mmol)反应，得化合物Ⅰ6白色粉末0.166 g，产率83 %，mp:201.2～203.7 ℃.1H NMR(600 MHz，DMSO)δ:9.49(s，1H，—NH)，7.49(d，J=5.0 Hz，2H，Ar—H2、6)，7.28(d，J=9.0 Hz，1H，—NH)，7.13(t，J=8.8 Hz，2H，Ar—H3、5)，5.20(s，1H，H-12)，3.54(s，3H，H-31，—COOCH3)，3.32(s，3H)，2.81～2.73(m，1H，H-3)，1.83(s，2H，H-2，—CH2)，1.12(s，3H，Me)，0.88(d，J=4.0 Hz，12H，Me)，0.80(s，3H，Me)，0.67(s，3H，Me).

2 结果与讨论

MVD软件能够通过函数打分形式，预测并计算蛋白质与小分子配体的相互作用，评分数值的绝对值越大表明化合物与受体亲和力越好[19]，齐墩果酸及其衍生物与VEGFR-2靶蛋白分子对接结果见表1.结果表明化合物与VEGFR-2靶蛋白(PDB编号：5EW3)的结合能均高于先导化合物齐墩果酸，其中化合物Ⅰ5和Ⅰ6的结合能较高，分别为-554.73 kJ/mol和548.73 kJ/mol，同索拉菲尼与靶蛋白的对接结合能相当.索拉菲尼是一种小分子VEGFR-2抑制剂，通过分子虚拟对接方法研究与VEGFR-2靶蛋白(PDB编号：5EW3)的相互作用(图2)，分子对接结果表明索拉菲尼与VEGFR-2靶蛋白氨基酸残基之间形成多个牢固的氢键，与靶蛋白产生较大结合力.化合物Ⅰ5与靶蛋白的分子虚拟对接结果(图3)表明Ⅰ5能较好地插入靶蛋白的活性口袋中，其中酯基、硫脲基和苯环取代基苯环上的氟取代基与氨基酸残基(VAL A:899，HIS A:895，ARG A:1027)紧密结合，形成牢固的氢键；同时，化合物Ⅰ5还可通过π—σ键、π—烷基键和碳氢键等与VEGFR-2靶蛋白的多个氨基酸残基(GLY A:893、ASN A：900、IEL A：892、HIS A：1082、ALA A：881、HIS A:894)结合.

表1 不同化合物与靶蛋白VEGFR-2的 结合能(PDB:5EW3)Table 1 Molecular docking scores between compounds and VEGFR-2 kinase

图2 索拉菲尼与VEGFR-2靶蛋白的分子对接模式Fig.2 Molecular docking mode between sorafenib and VEGFR-2 kinase

图3 化合物Ⅰ5与VEGFR-2靶蛋白的分子对接模式Fig.3 Molecular docking mode between Ⅰ5 and VEGFR-2 kinase

3 结 论

以齐墩果酸为先导化合物，设计并合成了6个未见文献报道的齐墩果酸硫脲类衍生物，目标产物结构经1H NMR确认.利用计算机辅助设计分子模拟对接法研究目标化合物和VEGFR-2激酶的结合情况，结果表明目标化合物与靶蛋白的结合能均明显高于齐墩果酸，其中化合物Ⅰ5和Ⅰ6与靶蛋白的结合能同索拉菲尼相当，具有进一步研究的价值.利用分子模拟对接方法对药物作用机制的研究具有重要意义，本研究对进一步优化设计齐墩果酸衍生物作为VEGFR-2抑制剂具有一定的参考价值.