Y染色体微缺失检测对男性不育的临床价值研究

张 燕，索 峰，缑灵山，王 亿，孙成才，王传霞，顾茂胜

(徐州市妇幼保健院遗传医学中心，江苏徐州 221000)

欧洲泌尿科学会(EAU)男性不育指南[1]中指出男性因素在致使育龄夫妇不孕不育的因素中约占45%～50%，且根据近年的研究发现，约有50%的男性不育皆因遗传缺陷[2]所致。Y染色体长臂上存在着与精子生成相关的基因，称为无精子症因子(Azoospermia factor,AZF),主要包括AZFa，AZFb以及AZFc三个区域[3]，这三个区域相互独立，互不干扰，任何一个区域的微缺失都将导致精子生成障碍，进而影响男性生育能力，其发生率在因精子生成障碍导致不育的因素中仅次于克氏综合征(klinefelter syndrome)，位居第二。故本研究对509例男性不育患者采用多重PCR技术进行Y染色体微缺失检测，探讨其对男性不育的临床诊疗价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2016年11月～2019年7月于徐州市妇幼保健院就诊的509例男性不育患者，年龄17～52岁，平均年龄33.2±5.9岁，其中包括初诊为不孕不育患者369例，已确诊为不同程度精子状态异常(包括少、弱、畸、死、无精子)患者117例，确诊为睾丸发育异常(包括不发育和发育不良)患者23例，所有入选患者均已排除生殖道感染、精索静脉曲张、输精管缺如等其他男性生殖系统疾病。采用真空采血管采集患者静脉全血2ml(EDTA抗凝)。

1.2 试剂和仪器 厦门致善生物科技股份有限公司生产的Lab-Aid 824核酸提取仪及其配套生产的Lab-Aid 824核酸提取Mini试剂,上海透景生命科技股份有限公司生产的SLAN 965实时荧光定量PCR仪及Y染色体微缺失检测试剂盒(PCR荧光探针法)。

1.3 方法

1.3.1 全血DNA提取：提取样本基因组DNA(ng/μl)，操作步骤按照试剂说明书进行。

1.3.2 Y染色体微缺失基因检测

1.3.2.1 PCR反应体系：检测Y染色体AZF区3对序列标签位点，包括AZFa(sY84,sY86),AZFb(sY127,sY134),AZFc(sY255,sY254),以及1对内对照位点SRY,ZFX/ZFY，每对位点对应探针依次用四种不同荧光染料(VIC,ROX,Cy5,FAM)标记。每个样本做A，B两组试验，A组检测位点为SRY,sY84,sY127,sY255；B组检测位点为ZFX/ZFY,sY86,sY134,sY254。操作步骤按照试剂说明书进行。

1.3.2.2 PCR反应程序：第一阶段：50℃ 2min,1个循环；第二阶段：95℃ 5min，1个循环；第三阶段：95℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s，38个循环，每个循环60℃时收集FAM/VIC/ROX/Cy5信号，并保存相关文件；第四阶段：72℃ 5min，1个循环。

1.3.3 结果判读：若扩增曲线出现相应典型S型曲线且Ct值小于32，则说明检测区域不存在基因缺失，反之，则存在缺失。

1.4 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行分析，采用行×列表资料χ2检验。取P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AZF微缺失结果分析 见表1。509例患者检出Y染色体缺失24例，检出率4.72%。三组数据差异具有统计学意义(χ2=13.004，P=0.002)。

表1 509例不育患者AZF微缺失发生率

2.2 AZF基因不同区域微缺失结果分析 见表2。24例Y染色体微缺失样本中，检出AZFc微缺失18例，检出率最高(75%)，其次为AZFabc三区同时缺失，AZFbc两区同时缺失及AZFb缺失检出率最低且相等。三组数据之间的差异具有统计学意义(χ2=15.093，P=0.020)。

表2 24例AZF基因微缺失不同缺失区域发生率[n(%)]

3 讨论

Y染色体是人类46条染色体中最短小的染色体，存在着大量的重复序列和回文序列，这两种序列的存在使得Y染色体很容易发生缺失。当缺失发生在AZF区域时，就有可能造成男性不育。根据文献报道发现，国内不同地区Y染色体微缺失发生率也不同，洛阳地区发生率为10.12%[4]，新疆地区发生率为6%[5]，贵州地区发生率为7.13%[6]，广东清远地区发生率为6.1%[7]，宁夏地区发生率为9%[8]。本研究509例患者检出24例AZF微缺失，检出率4.72%，稍低于其他地方，这与不同种族、研究对象入选标准、临床诊断类型以及标本量多少有关。

AZFa，AZFb，AZFc三个区域对应五种缺失模式：AZFa，AZFb，AZFc，AZFbc和AZFabc，本研究检出的24例微缺失中除AZFa缺失未检出外，其余缺失模式均被检出。其中AZFc缺失率最高(75%)，与2013年版欧洲男科协会(EAA)Y染色体微缺失诊断指南[9]中统计的AZFc缺失率(～80%)接近；AZFabc三区同时缺失检出率为16.66%，远远高于指南中AZFabc的缺失率(0.5%～4%)；AZFb和AZFbc的缺失率均为4.17%，与指南中统计的缺失率(1～5%，1～3%)接近。

AZFa区的基因主导精母细胞增生，整个AZFa区的缺失表现为唯支持细胞综合症(sertoli cell only syndrome,SCOS)，为绝对的无精子症，并伴有小睾丸症状[10]。本研究中未发现仅AZFa区缺失，但AZFabc三区同时缺失检出4例。AZFb区缺失的患者，生精阻碍在初级精母细胞阶段，没有精子生成。故患者只要检出包含AZFa和/或AZFb区的缺失都不建议做单精子胞浆内注射手术(intracytoplasmic sperm injection ,ICSI)[11]。

AZFc区缺失在临床上最常见，也是临床表现最为乐观的一种缺失。AZFc区缺失的患者其精子数量从无到正常，并通常伴有形态及活力异常。有研究显示[12]，AZFc区缺失的患者有一定的成功率可以通过ICSI来孕育后代，但这种缺失会遗传给男性后代[13]，故该类患者可行(孕前诊断PGD)辅助生殖，选择生育女性后代。本研究中有大量患者初次检查均笼统诊断为不育，后期检查后未更新精子状态等具体不育病因，在后续研究中还需随访更新，对于提高小组检出率有很大帮助。

综上所述，Y染色体AZF基因微缺失对于男性不育意义重大，通过检测可以帮助临床尽快明确部分男性不育的根本原因，从而指导临床制定出更加合理有效的辅助生殖诊疗方案，更好地造福于患者。