甘肃省武威市骆驼蜱及梨形虫病病原分子生物学调查

（民勤县畜牧兽医工作站，甘肃民勤 733399）

按中国动物地理区划，武威市属于古北界，地处黄土高原、青藏高原和蒙新高原三大高原交汇地带，地势西高东低，局部地形复杂，是典型的蒙新区西部荒漠和半荒漠地区，也是骆驼生息繁衍的理想场所。民勤县是闻名的“骆驼之乡”，豢养使役骆驼历史悠久，古有“汉马唐驼”的说法。多年来，武威市骆驼养殖一直以传统放牧为主，主要饲养于腾格里沙漠和巴丹吉林沙漠沿边区域。近年来，因政府发布禁牧政策，自由式的放牧已不再适应骆驼养殖业的发展，导致骆驼数量急剧减少。

动物梨形虫病是世界各国公认的、最重要的一类寄生虫病之一。该病在我国分布广泛，常呈地方性流行，给疫区畜牧业造成严重经济损失。20世纪70～90年代，王心娥等[1]、康新民等[2]、姚文炳[3]对河西三地区和阿拉善盟地区的骆驼蜱类区系做过详细调查，但仅作了蜱虫种类鉴定，而对梨形虫病病原在媒介蜱和贮藏宿主体内的感染分布情况未作详细描述。骆驼在自由放牧过程中接触环境中媒介蜱虫的概率较高。蜱虫可通过吸取宿主血液，造成骆驼贫血、消瘦、营养不良、内脏机能受损、生产性能下降，更为严重的是蜱虫可传播多种疾病，如不采取有效的防治措施，会给骆驼产业造成毁灭性打击。为深入了解和逐步保护开发骆驼产业，对武威市骆驼媒介蜱及其贮藏在体内的梨形虫病病原进行了分子流行病学调查。

1 材料与方法

1.1 试剂

大肠杆菌感受态细胞DH5α、TaKaRa ExTaq®、RNase-free Water、X-gal、IPTG，购自宝生物工程（大连）有限公司；pGEM-T Easy载体，为Promega公司产品；DNA提取试剂盒，购自QIAGEN公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒（ZymocleanGel DNA Recovery Kit），购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 基因组DNA

临床样品为2018年6—7月采自武威市“甘蒙”边界21匹骆驼体表的蜱虫及相对应骆驼的抗凝血样品，其中抗凝血样品21份、蜱样品40份。蜱样品为饥饿成蜱或半饱血雌蜱，其中雄蜱8只、雌蜱32只。使用QIAGEN公司的基因组提取试剂盒（No.51306）提取临床样品基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。梨形虫病病原阳性及阴性基因组DNA，均由中国农业科学院兰州兽医研究所外寄生虫与虫媒疫病团队提供。

1.3 方法

1.3.1 蜱虫形态学鉴定 借助显微镜，对采集的饥饿成蜱（雌蜱）进行形态学鉴定。

1.3.2 梨形虫病病原通用引物设计及基因扩增 参考文献[4-5]，设计合成扩增巴贝斯虫和泰勒虫（统称为梨形虫病病原）18S rRNA基因的巢式PCR通用引物2对：VP-1F（5'-CCT TCCTTTAAGTGATAAGGTTCAC-3'），VP-1R（5'-GACGGTAGGGTATTGGCCTmCCG-3'，简并碱基m=A+C）；VP-2F（5'-ATTACCCAATmC bGACACvGkGAGG-3'，简并碱基v=A+C+G，b=T+C+G，k=T+G，m=A+C）；VP-2R（5'-TTAAATACGAATGCCCCCAAC-3'）。以实验室保存的动物梨形虫病病原基因组为模板，分别以阳性基因组、阴性基因组和PCR用水为阳性对照、阴性对照和空白对照，在25 μL反应体系中进行第1轮扩增：10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L each）2.0 μL，TaqDNA polymerase 1.25 U，VP-1F和VP-1R引物（10 μmol/L）各1 μL，基因组模板1 μL，PCR用水补足至25 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。然后以扩增产物为模板，用VP-2F和VP-2R引物对进行第2轮扩增，反应体系同上。反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。扩增结束后，对PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶（含8 μL/100 mL的Goldview I 型核酸染色剂）电泳分析，观察扩增结果。在380～420 bp位置出现特异性目的条带时，判定为动物梨形虫病病原样品阳性。对扩增的阳性目的条带进行胶回收，将所得目的片段与pGEM-T Easy载体连接；连接产物转化到大肠杆菌Trans DH5α感受态细胞中，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性菌落。将PCR鉴定为阳性的重组质粒送西安擎科生物技术有限公司进行测序，测定的基因片段经BLASTn分析，鉴定引物扩增特异性区段的正确性。

2 结果

2.1 蜱形态学鉴定

通过显微镜对采集的饥饿成蜱（雌蜱）进行观察发现：盾板椭圆多角形，后缘尖窄，暗呈角状，亮褐至暗褐色；气门板逗点形，背突细窄，气门板后缘在背突基部较直；足粗细适中，呈黄褐色或赤褐色，关节的淡色环带及背缘谈色纵带较窄；爪垫短小，不及爪长一半。根据以上形态学特征，鉴定该蜱为亚洲璃眼蜱（图1）。

图1 蜱虫鉴定结果

2.2 蜱体内梨形虫病病原基因扩增

通过巢式PCR扩增鉴定，从骆驼体表采集的40份蜱样品中扩增出阳性样品1份，经测序鉴定为双芽巴贝斯虫；将扩增的序列提交GenBank，获得基因序列登录号MK418667。

2.3 骆驼抗凝血中梨形虫病病原基因扩增

通过巢式PCR扩增，在采集的21份骆驼抗凝血样中，未检测出巴贝斯虫和泰勒虫病原。

3 讨论

研究[1-2]显示：20世纪70～90年代，武威市骆驼蜱虫种类主要为钝跗硬蜱（Ixodes pomerantzevi Serdukova，1941年）、亚东璃眼蜱（Hyalomma asisticum kozlovi Olenev，1931年）、亚洲璃眼蜱（H.asistisum asiaticum Schlze &Schlottke，1929年）和波斯锐缘蜱（Argas persicus Oken，1818年）。此次调查所采集到的蜱虫经形态学鉴定为亚洲璃眼蜱，证实亚洲璃眼蜱依然是该地的优势种。亚洲璃眼蜱是一种三宿主蜱，主要分布于我国新疆、内蒙古、青海以及中亚地区；宿主广泛，以牛、羊、马、犬、兔、鼠等哺乳动物及鸟类为主[6]；而波斯锐缘蜱作为鸡蜱虫的优势种，孙明等[7-8]于2015年7月在民勤县苏武镇农户所养殖的家禽上已发现；其余两种蜱虫，近几年未有相关文献报道。

在国内外已有的文献中，骆驼泰勒虫（Theileria camelensis）仅为单峰驼的一种寄生虫，也是唯一一种寄生于骆驼的蜱传性寄生虫病[9]，主要分布于埃及和利比亚，在埃及的流行率为30%，在利比亚的流行率为6.5%，在伊朗也有发现[10-12]，但没有相关的流行病学数据公布。最近，对约旦单峰驼血液的分子研究[13]揭示了单峰驼中存在马巴贝斯虫（Babesia caballi）和马泰勒虫（T.equi），但是红细胞的显微镜检查并没有发现巴贝斯虫及泰勒虫。在感染泰勒虫的骆驼体表获得的硬蜱中，嗜驼璃眼蜱（Hyalomma dromedarii）为优势种。蒙古国双峰驼上寄生有亚洲璃眼蜱（Hy.asiaticum）、草原革蜱、达吉斯坦革蜱（De.daghestanicus）和短小扇头蜱（Rh.pumilio）的报道[14]，阿富汗[15]、伊朗[16]也有亚洲璃眼蜱叮咬骆驼的报道。此次流行病学调查在骆驼体表的蜱体内检出双芽巴贝斯虫病原，说明当地存在通过蜱传播梨形虫病的风险。本次调查虽然在骆驼抗凝血样品中并未检出梨形虫病病原，但这并不能说明该地骆驼中不存在梨形虫病流行，很有可能与此次样本的采样数量过小有关。

尽管国内外关于骆驼梨形虫病的报道不多，但骆驼体表的蜱虫作为动物梨形虫病病原或其他媒介动物疫病的贮存宿主，给公共卫生和人畜安全带来了严重威胁。有文献证实，骆驼上的蜱在环形泰勒虫病、东海岸热、牛心水病传播中起重要作用[17]，璃眼蜱和革蜱被列为马梨形虫病的传播媒介[18-19]；在我国内蒙古地区，草原革蜱和亚洲璃眼蜱是人西伯利亚立克次氏体的传播媒介。而本次在骆驼体表的蜱体内检出双芽巴贝斯虫，同样警示蜱作为动物梨形虫病病原的传播媒介，在叮咬宿主繁衍后代的同时也可传播疫病，如不采取有效的防治措施，将给养殖业造成严重影响。

综上所述，PCR技术具有快速、敏感、特异性高的优点，为骆驼蜱及梨形虫病的临床诊断和流行病学调查提供了有效的技术手段。此次调查，也是甘肃省基层兽医机构首次利用分子生物学检测手段，开展动物梨形虫病病原检测，将有助于全省基层兽医实验室提高动物疫病检测能力。