利用富硒菌体制备富硒酸乳

宋玉卿，汪鸿, ，耿浩源，吴楠，于殿宇，王俊国*

1. 吉林工商学院（长春 130507）；2. 东北农业大学食品学院（哈尔滨 150030）

硒是一种稀有元素[1]，是大多数温血类哺乳动物生理活动所必需的18种微量元素之一[2-3]，分为有机硒和无机硒[4-5]。硒具有抗氧化和抗癌作用[6-7]，还具有预防心脑血管疾病[8]、增强人体免疫力[9-10]等多种生物学功能。通过膳食摄取足够的硒，可起到预防有关疾病的作用[11]。然而，硒在地壳里的含量少且分布不均匀[12-13]。在中国许多地区硒摄入含量水平偏低，处于缺硒和低硒的状态[14]。研究表明，大骨节病、白内障、糖尿病等疾病与缺硒有关，所以高效低毒的补硒剂成为研究热点[15]。需要注意的是，硒的需要量与中毒量之间范围较小[16]，在食物补硒或药物补硒时要严格控制硒的量[17]。

现今，主要的补硒剂形式分为2种，一种是有机形式的硒代蛋氨酸，另一种是无机形式的亚硒酸钠，但这种补硒剂的转化率低且毒性偏高。而采用微生物代谢方式吸收无机硒转化为有机硒，既便宜又安全。现有研究表明酸乳发酵剂具有优良的富硒能力[18]，富硒培养后用来发酵牛乳，可显著提高酸奶中硒含量，因此富硒酸奶可有效增加人体对有机硒的摄入量，同时可有效减少奶中的应激因子对于发酵菌种的不利影响。

试验采用Lyofast LH 13瑞士乳杆菌、Lyofast LB 8保加利亚乳杆菌复合菌种进行富硒，通过单因素试验研并进行响应面优化试验确定最佳菌体富硒条件；利用最优富硒菌体发酵复原全脂牛乳并对所得富硒酸乳进行理化指标测定，为富硒食品的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Lyofast LH 13瑞士乳杆菌、Lyofast LB 8保加利亚乳杆菌：北京多爱特生物科技有限公司；MRS固体培养基粉：广东环凯微生物科技有限公司；亚硒酸钠：北京万佳首生物科技有限公司；3, 3-氨基联苯胺：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

高温蒸汽杀菌锅，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；754型紫外分光光度计，上海分析仪器厂；NDJ-5S流变仪，苏州赛恩斯仪器有限公司。

1.2.1 MRS液体培养基制备

取固体培养基粉末54.0 g，加入蒸馏水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装到100 mL的MRS液体培养基，在121 ℃下高压灭菌15 min，待用。

1.2.2 菌体富硒方法

将Lyofast LH 13瑞士乳杆菌和Lyofast LB 8保加利亚乳杆菌复合菌体接入至MRS液体培养基中进行活化，摇匀，在37 ℃恒温培养箱中培养72 h；配制一定浓度的亚硒酸钠溶液，灭菌，在无菌条件下，将亚硒酸钠溶液加入到1.3.1中分装好的100 mL的MRS液体培养基中，摇匀后接入活化的复合菌体，放置于37 ℃恒温培养箱中进行富硒培养。

1.2.3 试验设计优化菌体富硒条件

对复合菌体进行单因素试验。在瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌为1∶1混合菌种条件下，考察硒质量浓度（3，6，9，12和15 μg/mL），加入硒时间（0，5，15，25和35 h），富硒培养时间（40，50，60，70和80 h），接种量（菌悬液体积分数2%，3%，4%，5%和6%）对菌体含硒量影响。依据单因素试验结果，进行响应面优化，并进行验证试验。

1.2.4 液态发酵剂制备

收集复合菌体富硒培养产物，将其置于50 mL无菌离心管内，在10 000 r/min，4 ℃下离心10 min。弃去上清液，用生理盐水洗涤菌体3次，后取一定量的预先经过121 ℃灭菌的复原乳冲洗复合菌体至菌体表面无机硒无残留并稀释至约4.0×108CFU/mL浓度，制得液态富硒发酵剂。

1.2.5 富硒菌体发酵方法

参考文献[5]发酵方法并加以改进，试验采用富硒发酵剂接种量5%，在发酵温度43 ℃条件下，对复原牛乳进行发酵，发酵时间6 h，冷却至4 ℃后熟12 h。

1.2.6 硒含量测定

硒含量测定：3, 3-氨基联苯胺法[19]。

1.2.7 发酵酸乳贮藏稳定性测定

将发酵后熟的富硒酸乳在4 ℃下贮藏21 d，分别对0，3，6，9，12，15，18和21 d时富硒酸乳的酸度、pH、黏度和持水率进行测定。

1.2.7.1 发酵酸乳酸度测定

测定时取10 mL样品于锥形瓶中，加入20 mL蒸馏水稀释，滴入几滴0.5%酚酞作指示剂，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，按所消耗的NaOH的毫升数表示酸度。

1.2.7.2 发酵乳黏度测定

采用流变仪进行测定。取适量的样品酸奶于烧杯中，调节转速50 r/min，将转子放入待测样品酸奶中测定其黏度，记录下前3次数据，取平均值。

1.2.7.3 发酵pH测定

20 ℃下，用pH计直接测定样品酸奶的pH，等待数据稳定后，记录数据即可。

1.2.7.4 发酵酸乳持水率测定

取25 g酸乳样品，置于高速离心机内，在25 ℃，5 000 r/min条件下离心25 min[28-29]。弃上清液，测量离心后乳清质量。

式中：m1为离心后析出乳清质量，g；m2为酸乳质量，g。

1.2.7.5 数据分析

数据采用Origin 8.6与Design Expert 8.0.6进行分析和绘制。用SPSS 17.0进行ANOVA单因素方差分析，并采用Tukey检验（p＜0.05）检验数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 硒标准曲线

绘制得硒标准曲线结果如图1，得线性回归方程y=0.024 9x+0.005 8，相关系数R2=0.997 4。

图1 硒标准曲线

2.2 不同富硒条件对菌体含硒量的影响

2.2.1 不同硒浓度对菌体含硒量的影响

无菌条件下，在MRS液体培养基中接入5% 1∶1的复合菌体，置于37 ℃的恒温培养箱中培养。在菌体培养25 h后分别加入亚硒酸钠，使MRS液体培养基质量浓度为3，6，9，12和15 μg/mL，摇匀后于37 ℃恒温培养箱中培养60 h，后测定菌体含硒量。

不同硒浓度对菌体含硒量的影响如图2所示。硒质量浓度在3～9 μ g/mL范围内，Lyofast LH 13瑞士乳杆菌和Lyofast LB 8保加利亚乳杆菌混合菌体含硒量先上升，在硒质量浓度9 μg/mL时菌体含硒量最高。随后菌体含硒量变化不显著，这是因为亚硒酸钠有一定毒性，过量的亚硒酸钠对复合解菌体生长和菌体正常代谢有抑制性[20-21]，使复合菌体对硒的转化能力有所下降。所以加硒质量浓度为9 μ g/mL时，复合菌种富硒效果最佳。

图2 不同硒质量浓度对菌体含硒量的影响

2.2.2 不同加硒时间对菌体含硒量的影响

在MRS液体培养基中接入5% 1∶1的混合菌种，置37 ℃恒温培养箱中培养，分别在复合菌体培养0，5，15，25和35 h后加入亚硒酸钠溶液并保持MRS液体培养基中硒含量9 μg/mL，置于37 ℃恒温培养箱中富硒培养60 h，测定菌体含硒量。

加硒时间对菌体含硒量的影响如图3所示。Lyofast LH 13瑞士乳杆菌和Lyofast LB 8保加利亚乳杆菌复合菌体随着加入硒溶液时间的延长，菌体含硒量上升，在复合菌体培养后25 h时加硒，菌体含硒量达最高。此时菌种处在对数生长期，繁殖代谢能力旺盛。且微生物转运，还原硒以及对硒的其他代谢需要专一性的酶，同时受到环境pH影响。在培养25 h后，pH下降，菌体体内硒的运载载体对硒的运载效率下降，富硒效果下降。所以在25 h时加入硒最佳。

图3 不同加硒时间对菌体含硒量的影响

2.2.3 不同富硒培养时间对菌体含硒量的影响

在MRS液体培养基中接入5% 1∶1的混合菌种，在菌体培养25 h后加入亚硒酸钠溶液，保持MRS液体培养基中硒含量9 μg/mL，置于37 ℃恒温培养箱中分别富硒培养40，50，60，70和80 h，测定菌体含硒量。

富硒培养时间对菌体含硒量的影响如图4所示。在40～60 h，复合菌体含硒量呈上升趋势。在60 h时，菌体含硒量最高，随后菌体含硒量下降。这是因为微生物在最适条件下，可以保持最佳生长状态，随后因培养基中硒含量不足，菌体转化硒受限。培养时间过长，菌体发生老化，其增殖能力和富硒能力有所下降，在60 h后菌体含硒量呈下降趋势。因此，适宜的富硒培养时间为60 h。

图4 不同富硒培养时间对菌体含硒量的影响

2.2.4 不同接种量对菌体含硒量影响

分别以2%，3%，4%，5%和6%不同接种量在MRS液体培养基中接入1∶1的混合菌种，在复合菌体培养25 h后加入亚硒酸钠溶液，并保持MRS液体培养基中含硒量9 μg/mL，在37 ℃恒温培养箱中富硒培养60 h，测量菌体含硒量。

接种量对菌体含硒量的影响如图5所示。接种量的大小影响到菌体的生长和富硒能力。接种量过大，会引起菌体生长过于旺盛，菌体内竞争，相互抑制，复合菌体生长不充分，其代谢和富硒力下降。接种量过小，菌体浓度小，菌体生长、代谢缓慢，影响富硒效果。当接种量从2%～5%时，菌体含硒量随接种量增加而呈上升趋势随后变化不显著。所以接种量在5%时最佳，菌体含硒量最高。

图5 不同接种量对菌体含硒量的影响

2.2.5 响应面优化

在单因素试验的基础上，对菌体发酵过程进行响应面优化试验，研究采用Box-Benhnken中心组合设计，在复合菌体培养25 h后加入硒溶液，选取硒浓度（A）、接种量（B）、培养时间（C）为自变量，以菌体含硒量（R）为响应值设计三因素三水平响应面试验，因素水平编码见表1。试验设计方案及结果见表2。

利用Design Expert 8.0.6软件对试验结果进行方差分析，（p＜0.05为显著项）。将试验数据进行多元回归拟合，得到菌体含硒量（R）对硒质量浓度（A）、接种量（B）、培养时间（C）的回归方程为：R=+543.60+7.88A+11.25B+8.38C+6.50AB+14.25AC-15.50BC-40.43A2-31.18B2-24.92C2。

表1 因素水平表

表2 响应面设计方案及试验结果

图6分别给出硒浓度、接种量和培养时间交互作用对菌体含硒量的响应曲面图。

图6 菌体含硒量值响应面图

由图6可以看出，3个变量：硒质量浓度（C）、接种量（B）、培养时间（C）。在两两交互时，保持其中1个变量不变，随着另外2个变量的增加，菌体含硒量呈上升趋势，当达到一定值时又呈下降趋势。其中，培养时间和硒浓度对菌体含硒量影响较大，硒浓度和接种量对菌体含硒量的影响较大，其中培养时间和接种量对菌体含硒量影响最大。

应用响应面优化分析方法对回归模型进行分析，寻找最优响应结果见表3。

为检验在响应面优化出的条件下所得结果的可靠性，进行验证试验，得到的菌体含硒量554 μg/g，响应面优化的预测值与试验值之间的拟合性良好。

表3 响应面寻优结果

2.3 酸度和pH测定

pH和酸度的变化如图7所示。富硒酸乳的酸度随着贮藏天数的增加有所增加，在第21天时达到97.4°T，在贮藏期内变化明显。其pH有所下降随后变化缓慢趋于稳定。由于随着时间的变化，酸乳pH下降，富硒酸乳处在酸性环境，乳酸菌的增殖活力下降，乳酸菌产生乳酸速度变慢，使pH和酸度趋于稳定。

图7 酸度和pH随贮藏天数的变化曲线

2.4 持水率和黏度测定

图8 持水率和黏度随贮藏天数的变化曲线

持水率和黏度是酸乳的重要品质指标，影响酸奶的稳定性。从图8中可以看出，黏度随贮藏天数的增加有所上升，第9天时达到最大值，因为贮藏期内随着酸乳pH的降低，有利于酸奶凝胶的形成。在第9天后酸乳的黏度下降，由于在酸乳中，残留的霉菌繁殖旺盛，分解酸乳中的凝胶物质，使得黏度下降。持水率随着贮藏天数的增加而有所下降。在前7 d内变化明显，随后趋于稳定。这是由于在贮藏期内，随着pH的下降，酸乳的酸度变化较大，乳清析出明显，酸乳稳定性下降，蛋白凝胶性变差，对酸乳的结构稳定有不良影响，使得其中的水分析出，持水率下降，后期酸乳中的活性菌生长缓慢，产酸减少，对酸乳的结构稳定性影响减弱，故持水率下降缓慢。

2.5 富硒酸乳中有机硒含量测定

酸乳中有机硒含量变化如图9所示，在贮藏期内，酸乳中有机硒含量变化不明显，趋于稳定。按1.2.6小节的方法测量硒含量，酸乳在贮藏期内有机硒含量可达27.7 μg/kg。这是因为有机硒在酸乳中存在形式稳定，酸乳的酸度、pH和黏度等变化对有机硒稳定性影响不大。所以有机硒可以稳定的存在酸乳中，可为人体提供良好的硒来源。

图9 酸乳中有机硒含量随贮藏天数变化曲线

3 结论

通过单因素试验及响应面法优化分析得到菌体富硒最优条件：Lyofast LH 13瑞士乳杆菌和Lyofast LB 8保加利亚乳杆菌接种复合比例1∶1，加硒质量浓度10 μ g/mL，接种量5%，培养25 h后加入硒溶液，培养时间60 h。利用此最优条件下得到复合菌体含硒量554 μ g/g，硒转化率为55.4%，菌体含硒量较高。经过在贮藏期内富硒酸乳理化指标的检测，结果表明，酸度、pH、黏度和持水率等指标良好且酸乳中硒含量稳定。因此，此富硒酸乳能为人体硒的摄入提供良好的来源。