牙鲆鱼片冷藏过程中蛋白质降解规律及预测模型的构建

徐永霞 李 涛 冯 媛 曲诗瑶 赵洪雷 谢 晶 李学鹏* 励建荣*

（1 渤海大学食品科学与工程学院 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心辽宁锦州121013 2 西南大学食品科学学院 重庆400715 3 上海海洋大学食品学院 上海201306）

牙鲆 （Paralichthys olivaceus），俗称牙片、偏口、平目等[1]，为冷温性、底栖型海水鱼类，主要分布在南、北美洲的东西岸，以及亚洲地区的渤海、黄海、东海和南海，是中国、日本及韩国等的重要海水养殖经济鱼类[2]。牙鲆鱼肉质细嫩鲜美，含有丰富的水分和蛋白质，是做生鱼片的上等材料，深受消费者的喜爱，市场前景十分广阔。

蛋白质是鱼类等水产品中最重要的营养物质之一，通常会因贮藏过程中多种环境因素的影响而发生分解。蛋白质降解是鱼肉贮藏和加工过程中一个重要的生化变化，一方面会导致其肉质的松散，另一方面也会引起风味品质的劣变。鱼类在低温贮藏过程中，由于内源酶的作用会导致肌肉蛋白质分解产生小分子肽类、氨基酸等中间产物；同时，微生物的代谢产生了各种酶，肌肉蛋白质及其中间产物在这些酶的作用下被进一步分解，生成氨及胺类、硫化物、醛、醇和酸等挥发性产物，使鱼体气味劣变，产生腥臭味[3-4]。研究发现，硫化氢、甲基硫醇和二甲基硫是冷藏鳕鱼在腐败高级阶段产生硫化物异味的原因，这些挥发性硫化物可能是鱼肉中游离的半胱氨酸和蛋氨酸经微生物降解产生[5]。由此可见，鱼类等水产品的品质劣变与肌肉蛋白质降解之间存在密切联系。

本研究对牙鲆鱼片在不同贮藏温度下的挥发性盐基氮（TVB-N）、TCA-可溶性肽、游离氨基酸含量以及菌落总数的变化进行测定，探究鱼片贮藏过程中的蛋白质降解规律，并在此基础上建立基于蛋白质降解指标的货架期预测模型，以期为牙鲆鱼冷藏过程中品质的控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牙鲆（购于锦州市林西街水产市场），鲜活运至实验室，每尾重约600～800 g。

三氯乙酸、氢氧化钠、Folin-酚试剂、茚三酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AB135-S 电子天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；900 型自动封口机，温州市德尔机器有限公司；ecatorTM蛋白消化仪，瑞典Foss 公司；Kjeltec 8400 型全自动定氮仪，瑞典Foss 公司；Biofuge stratos 台式冷冻高速离心机，美国Thermo Fisher 公司；T25 高速分散机，德国IKA 公司；UV-2550 分光光度计，日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 鲜活的牙鲆，击打头部致死，去皮后取背部肌肉，去离子水洗净、沥干，在无菌操作台上将切好的鱼片装入无菌蒸煮袋，用封口机空气密封包装后分别置于-2，0，4，7，10 ℃冰箱中贮藏。

1.3.2 感官评价 参考表1的评分标准对鱼片进行感官评定。评分小组由7 名经专业训练的人员组成（3 男4 女），人员固定，分别对鱼片的色泽、气味以及弹性进行评价，以鱼片的感官评分平均值作为感官评价结果。

表1 牙鲆鱼片感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standard of Paralichthys olivaceus fillets

1.3.3 菌落总数测定 根据GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[6]中描述的方法，采用稀释平板计数法测定菌落总数。

1.3.4 TCA-可溶性肽测定 准确称取3.00 g 绞碎的鱼肉样品，加入27 mL 5%的TCA 溶液，均质后在4 ℃下静置1 h，然后在5 000 g 离心10 min，取上清液用Lowry 法测定可溶性肽含量。

1.3.5 TVB-N 值测定 参考FOSS 应用子报中《鲜鱼和冻鱼中挥发性盐基氮（TVB-N）的测定》进行测定[7]，单位用mg N/100 g 鱼肉表示。

1.3.6 游离氨基酸含量测定 采用茚三酮比色法测定游离氨基酸的含量[8]。

1.4 数据分析

用Origin8.5 软件和SPSS17.0 软件进行数据处理、作图以及方差分析，所得数据为3 次结果的平均值，P＜0.01 为差异极显著，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 感官评定

牙鲆鱼片在不同温度贮藏条件下的感官评定结果如图1所示，由图可知，鱼片的感官分值均随贮藏时间的增加而显著下降（P＜0.05）。新鲜牙鲆色泽鲜明，肌肉组织紧致富有弹性，肌肉切面带有光泽，具有海水鱼固有的气味。随着贮藏时间的增加，肌肉弹性、色泽以及气味均变差。-2 ℃和0 ℃贮藏过程中的鱼肉样品感官品质明显比4 ℃、7 ℃以及10 ℃样品高，贮藏温度与感官评分呈负相关，说明低温贮藏能更有效地延缓鱼片感官品质的下降。据报道，冷藏鱼肌肉软化的主要原因是蛋白酶对细胞外基质蛋白质尤其是V 型胶原蛋白质的分解所致[9]。随着贮藏时间的延长，鱼肉内部蛋白质在内源及外源酶的作用下逐渐分解成为醇类、醛类、酮类、有机酸及氨、胺类、硫化物和其它小分子产物，导致肉体色泽逐渐暗淡，肌肉逐渐松散、弹性变差，固有气味逐渐消失并出现腐败臭味，严重影响其感官品质[10]。

2.2 菌落总数的变化

鱼类等水产品的腐败主要是由微生物作用引起的。微生物的代谢产生了各种酶，鱼肉蛋白质和氨基酸等物质在这些酶的作用下被进一步分解，生成氨及胺类、硫化物和醛类等挥发性化合物，使鱼体产生令人不愉快的气味和腥臭味[3-4]。因此，贮藏过程中微生物数量的变化可直接反映鱼肉降解腐败的进程[11]。由图2可知，随着贮藏时间的延长，5 组样品的菌落总数均呈显著的线性增加趋势，且贮藏温度越高菌落总数增长速度越快（P＜0.05）。其中10 ℃样品组微生物生长速度最快，贮藏7 d 左右时菌落总数达到了二级鲜度的标准[6 lg（CFU/g）]，其次是7，4，0 ℃样品组，-2 ℃样品组微生物生长最慢，在贮藏15 d 才超过可食用限度，这表明低温贮藏能有效抑制牙鲆鱼体内微生物的生长，延长贮藏的货架期。

图1 不同贮藏温度下鱼片感官评分的变化Fig.1 Changes in sensory value of fillets at different storage temperatures

图2 不同贮藏温度下鱼片菌落总数的变化Fig.2 Changes in TVC of fillets at different storage temperatures

2.3 TVB-N 含量的变化

挥发性盐基氮（TVB-N）是反映鱼肉蛋白质在酶和微生物作用下分解形成氨及胺类等碱性含氮物质的含量[12]，TVB-N 值是判断鱼类腐败程度的重要指标。根据GB/T 18108-2008 规定，海水鱼的可食用标准为TVB-N 值≤30 mg N/100 g。不同贮藏温度下牙鲆鱼片的TVB-N 含量随贮藏时间的变化情况如图3所示，由图可知，新鲜牙鲆鱼片的初始TVB-N 含量为8.5 mgN/100 g，随着贮藏时间的延长，不同温度下冷藏的样品TVB-N 值均呈上升趋势，且贮藏温度与TVB-N 值的增速呈正相关，其中，7 ℃、10 ℃贮藏的鱼片TVB-N 值上升速度显著高于其它组（P＜0.05），4 ℃贮藏样品TVBN 值上升速度次之，-2 ℃和0 ℃贮藏的样品TVBN 值上升速度较为缓慢。这说明贮藏温度是影响蛋白质降解速度的关键指标之一，较低的温度能很好地抑制鱼肉内源酶的活性和微生物的生长繁殖速度，从而减缓蛋白质等的降解速度。

2.4 TCA-可溶性肽含量的变化

蛋白质分解会形成大量肽，可溶性肽含量的变化趋势可以在一定程度上反映出蛋白质的分解情况[13]，其值越高，鱼肉中的蛋白质分解程度越严重。牙鲆鱼片在不同温度贮藏过程中TCA 可溶性肽含量的变化如图4所示。在0 天时TCA 可溶性肽的含量为47.15 μg/mL，随着贮藏时间的延长，5组样品的TCA-可溶性肽含量均逐渐上升，且不同温度处理组之间的可溶性肽含量差异显著 （P＜0.05），说明温度对TCA-可溶性肽的影响显著，贮藏温度越高，可溶性肽含量增长速率越快。其中-2 ℃和0 ℃贮藏样品中TCA-可溶性肽含量上升较为缓慢，可能是由于低温抑制了微生物的生长和蛋白酶的活性，使蛋白质的降解速度变慢，从而减缓了TCA-可溶性肽含量的增长。

2.5 游离氨基酸含量的变化

鱼类在低温贮藏过程中，由于内源酶和微生物的作用会导致肌肉蛋白质分解产生一系列小分子肽、氨基酸等中间产物，尤其是微生物产生的一些氨基酸脱羧酶的作用[14]，使肌肉中氨基酸含量增加，氨基态氮和游离氨基酸含量可一定程度上反映蛋白质降解情况，其含量过高，表明鱼体鲜度变差[15]。不同贮藏温度下牙鲆鱼片中游离氨基酸总量随贮藏时间的变化情况如图5所示，由图可知，随着贮藏时间的延长，鱼肉中游离氨基酸的含量均呈明显的上升趋势（P＜0.05），且贮藏温度越高，游离氨基酸的含量上升速度越快，可能是由于在较高贮藏温度下，鱼肉中微生物生长繁殖较快，其新陈代谢产生的各种酶类数量以及酶活性也会显著增加，从而使肌肉蛋白质分解更加迅速。

图3 不同贮藏温度下鱼片TVB-N 值的变化Fig.3 Changes in TVB-N content of fillets at different storage temperatures

图4 不同贮藏温度下鱼片TCA-可溶性肽含量的变化Fig.4 Changes in TCA-soluble peptide content of fillets at different storage temperatures

图5 不同贮藏温度下鱼片游离氨基酸含量的变化Fig.5 Changes in free amino acids content of fillets at different storage temperatures

3 牙鲆贮藏过程中品质变化的动力学模型

3.1 反应级数的确定

食品品质的变化可以用化学反应动力学模型来描述，且大多数食品的品质变化与时间关系都遵循零级或一级反应动力学规律[13]。标准的零级和一级反应方程式分别为（1）和（2）：

式中，Ct——贮藏t 时间（d）后的某品质指标；C0——初始的某品质指标；k--反应速率常数；t——贮藏时间（d）。

将牙鲆鱼片贮藏过程中测得的各品质指标变化分别用零级和一级反应方程即（1）和（2）进行拟合，所得拟合系数如表2所示。由表可知，不同冷藏温度下牙鲆鱼片蛋白质降解指标的决定系数R2值各不相同，R2值越大说明蛋白质降解指标与一级反应动力学方程拟合程度较好。各项指标的一级动力学方程拟合系数较高，因此，一级反应动力学方程可以很好地描述不同冷藏温度下牙鲆鱼片蛋白质的降解情况。

3.2 动力学预测模型建立

用一级反应动力学方程对不同冷藏温度下牙鲆鱼片的TVB-N 值、TCA-可溶性肽含量、游离氨基酸含量及菌落总数进行回归拟合，可得到蛋白质降解指标值的反应速率常数k，结果见表3。

温度变化会显著影响鱼类等水产品贮藏过程中的品质，温度是影响鱼肉贮藏过程中生化反应速率的重要因素，反应速率常数k 是温度的常数，通常用阿伦尼乌斯（Arrhenius）方程来表述温度与反应速率之间的关系[16]：

式中，k0——频率因子；T——绝对温度，K；R——气体常数，8.314 J/（mol·K）；Ea——活化能，J/mol。

温度升高，水产品中化学反应速率随之增大。在温度变化范围不大的情况下，Arrhenius 模型可精准描述温度与反应速率的关系[17]。为了更好地描述温度对水产品化学反应的影响规律，通常将Arrhenius 方程与水产品品质函数相结合，表述不同温度贮藏条件下水产品的品质变化，求得各品质指标的活化能，建立基于不同贮藏温度的水产品货架期预测模型[18]。本研究将不同冷藏温度下得到的牙鲆鱼片蛋白质降解各指标值的反应速率常数k 值用Arrhenius 方程进行拟合，计算出各指标的Ea 和k0值，并根据确定的反应级数方程，建立相应的动力学预测模型，结果见表4。

表2 零级与一级热力学反应方程拟合系数Table 2 Fitting coefficients of zero order and first-order thermodynamic reaction equations

表3 牙鲆蛋白降解一级动力学方程参数Table 3 The first dynamic equation parameters of Paralichthys olivaceus protein degradation

表4 牙鲆蛋白降解动力学预测模型Table 4 Dynamic prediction model of Paralichthys olivaceus protein degradation

4 动力学模型验证和预测

为验证模型的准确性，将牙鲆鱼片在1，3 ℃下贮藏4 d，测得的TVB-N、TCA 可溶性肽、游离氨基酸含量以及菌落总数的实际值与预测值之间的相对误差见表5。由表可知，所建立的蛋白质降解预测模型的预测值与实际值偏差均在±10%以内，说明牙鲆鱼片的实际货架期与建立模型后预测的货架期较为接近，因此TVB-N 模型、TCA-可溶性肽模型、游离氨基酸模型以及菌落总数模型均能较好地预测冷藏温度下牙鲆鱼片的蛋白质降解过程和货架期。其中TVB-N 值的相对误差分别为8.6%和6.0%，略高于其它指标在这两个温度下的相对误差，而菌落总数和TCA-可溶性肽的预测值更接近实际值，因此菌落总数和TCA-可溶性肽预测模型能更好地预测牙鲆鱼片在-2～10 ℃贮藏过程中的品质变化。

表5 牙鲆蛋白降解模型验证结果Table 5 The prediction model validation results of Paralichthys olivaceus protein degradation

5 结论

研究了不同贮藏温度对牙鲆鱼片蛋白质降解情况的影响，结果表明，随着贮藏时间的延长，牙鲆的感官指标呈下降趋势，TVB-N 值、TCA-可溶性肽、菌落总数以及游离氨基酸均呈上升趋势，且温度越高，蛋白质降解程度越明显，各指标的变化遵循一级反应动力学方程。根据确定的TVB-N值、TCA-可溶性肽、菌落总数以及游离氨基酸预测模型系数，得到Arrhenius 方程回归系数大于0.9，具有较高的拟合精度。经验证，模型的预测值与实际值的相对误差均在±10%以内，因此，该模型能很好地预测-2～10 ℃贮藏温度范围内牙鲆鱼片的品质变化，可为预测和控制冷藏温度下牙鲆鱼片的品质提供参考。