鱼源腐败希瓦氏菌生长/非生长界面模型的建立和验证

郭全友 朱彦祺，2 姜朝军 李保国

（1 中国水产科学研究院东海水产研究所 上海200090 2 上海理工大学医疗器械与食品学院 上海200093）

腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）属于革兰氏阴性菌，适宜低温下生长[1-2]，能产生H2S、TMA、CH4SH 和（CH3）2S 等挥发性物质，腐败潜力强，被确认为有氧冷藏海水鱼的特定腐败菌（Specific spoilage organisms，SSO）[3-4]。研究者针对水产品腐败希瓦氏菌生态特性、生长动力学、货架期预测、靶向抑制和抑菌机制等进行了探究，如修艳辉等[5]研究了环境因子对大黄鱼腐败希瓦氏菌生长影响的计数法。蓝蔚青等[6]研究了复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抑菌机理。水产品在加工、销售、流通和贮藏过程中微生物受内在和外在因子的影响，特别在运输过程中温度易产生波动，多因子交互作用下可能产生拮抗和协同作用。

通过设置“抑菌栅栏”和改变栅栏强度达到抑制微生物的作用。采用微生物生长／非生长（Growth/no growth，N/NG）界面模型可定量分析不同栅栏下目标微生物生长的可能性 （或概率），获得不同环境因子下的生长／非生长信息，定量调节水产品内外环境，达到杀灭或抑制作用。微生物生长/非生长界面模型常采用Logistic 回归法[7]，食品中微生物生长/非生长界限模型多为致病菌模型，如单增李斯特菌[8]、黄曲霉菌和蜡样芽孢杆菌等模型[9]，用于控制微生物毒素的产生，保障食品安全。目前食品腐败菌模型的开发相对较少，如乳酸菌和结合酵母[10]等，通过定量控制微生物的生长/非生长，延长产品的货架期。人工神经网络（Artificial neural Network，ANN）在食品加工工程中已广泛应用[11]，其中PNN（Probabilistic Neural Network）神经网络算法适用于生长／非生长模型的建立，具有结构简单和训练速度快的特点，可利用线性学习算法实现非线性学习算法的功能，对微生物生长/非生长数据进行快速分类[12-13]。采用Logistic 回归法和PNN 人工神经网络算法构建aw、pH 及盐分交互作用下腐败希瓦氏菌生长/非生长界面模型未见研究报道。

本文选取鱼源腐败希瓦氏菌为研究对象，研究室温（25 ℃）条件下pH、aw 及盐分（NaCl）对菌株腐败希瓦氏菌生长概率的交互影响，采用二阶线性Logistic 回归方程拟合和PNN 人工神经网络算法构建环境因子交互作用下生长/非生长界面模型。旨在评估鱼源腐败希瓦氏菌在pH、aw 和盐分范围的生长动态，开发高效抑菌及定量评估方法，为保障海产品鲜度和品质安全提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株D1 从低温有氧贮藏大黄鱼货架期终点时分离，16SrRNA 测序鉴定为腐败希瓦氏菌（序列号：KY786336），4 ℃保藏。

1.2 试验试剂及仪器

胰蛋白胨大豆肉汤 （TSB）；胰蛋白大豆琼脂培养基 （TSA）；1.0%盐酸；1.0%氢氧化钠；甘油和氯化钠（国药集团化学试剂有限公司，上海）。

水分活度仪（AW LAB-Touch PMB35），大昌华嘉商业中国有限公司；pH 计（pHS-3C），上海雷磁仪器厂；微生物生长测定仪 （Bioscreen C），芬兰；洁净工作台（SW-CJ-1FB），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；低温培养箱（MIR-153），日本三洋公司。

1.3 培养基制备

采用TSB 作为培养基。参考文献[5]25 ℃时，pH≤5.0 或aw≤0.920 或NaCl≥12%时，腐败希瓦氏菌不生长，海水平均盐度为3.5%，故交互试验因素和水平设计如表1所示，选取均分水分活度0.90，0.92，0.94，0.96 作为训练集建立模型，为避免误差选择具有代表性的相同水分活度0.91 为验证集，计120 种工况，每种重复4 次和1 个空白平行。通过灭菌甘油调节水分活度，0.1 mol/L 稀盐酸和0.1 mol/L 氢氧化钠调节pH。

表1 腐败希瓦氏菌pH，aw 和盐分交互试验设计Table 1 The design of the group of the Shewanella putrefaciens under different pH，aw and NaCl

1.4 菌悬液制备与接种

菌株活化：取腐败希瓦氏菌接种于无菌营养肉汤中，振荡30 s，25 ℃培养24 h，划线得到单菌落。

菌株接种：把调节过pH、aw 和盐分的TSB 经121 ℃灭菌后接入100 孔微孔板，每孔180 μL，取105CFU/mL 的菌悬液20 μL，最终接种液浓度为4.5 lgCFU/mL，接种入孔，每个条件4 组平行，1 个空白，25 ℃培养，每隔1 h 测定其OD600nm值，测试周期为7 d。

1.5 生长/非生长边界确定

当试验结束时，微孔中出现明显沉淀物或混浊，OD 值高于空白3 倍则判定为生长[14-16]，判定为生长时，取微孔中培养液100 μL 涂布于TSA 平板上，验证菌株是否仍为纯菌株。当OD 值1～3 倍之间时，涂布TSA 平板验证，若平板出现典型菌落，

菌数与初始菌量差＞0.5 lgCFU/mL 时，则判定为生长。每种情况下的生长概率由重复孔的生长情况计算获得，如4 孔中2 孔生长则该情况下生长概率为50%。

1.6 建立生长/非生长模型

1.6.1 Logistic 模型建立 依据试验设计选取90例数据为训练集用来建立模型，Logistic 模型如式1 所示[17]：

式中：p——生长／非生长概率；bi（0～9）——拟合参数；Na——盐分（V/V）。

1.6.2 PNN 人工神经网络模型建立 PNN 人工神经网络模型是基于Bayes 分类规则与Parzen 窗的概率密度函数估计方法发展而来的一种并行算法[18-19]。

将试验数据归一化后，依据试验设计选取90例数据，盐分、pH 和aw 作为三维向量进入输入层，在Matlab 软件中进行训练，输出层神经元设定为1，结构概率≤0.5 的记作1 类非生长，＞0.5的记作2 类生长。训练完成后剩余30 例数据作为验证输入，验证训练模型的准确性。

1.7 模型拟合优度及预测力评价

1.7.1 拟合优度评价Logistic 模型 拟合优度采用似然比测试（-2lnL，the likehood test）、赤池信息准则（AIC=-2lnL+2k，Akaike's information criterion）、Hosmer-Lemeshow 测 试 （HL）和R2-Nagelkerke 进行评价。-2lnL、AIC 常用于模型拟合优度评判，数值越小，证明拟合效果越好。Hosmer-Lemeshow 用于评估模型任意数量的连续与分散的解释变量的拟合优度，数值越小，拟合效果越好，但无法将标准偏差纳入考虑，一个不理想的预测值亦可能导致该值的升高，故常结合R2-Nagelkerke 值一起考虑，R2-Nagelkerke 值主要反映了解释变量与响应变量间的关系，其值越接近1，拟合优度越好。

1.7.2 预测力评价 Logistic 模型与PNN 人工神经网络模型预测力采用C-matrix 获得的一致率（Fraction correct，FC）和假阳性率 （False alarm rate，FAR）进行比较，FC 值越接近于100%说明预测效果越好，FC 值为预测值与实际值的吻合度，FAR 为假阳性错判率，可作为模型的预测准确度的参考。公式如下：

1.8 模型验证

选取30 例数据为验证集对模型进行验证，带入建立的Logistic 模型与PNN 人工神经网络模型中，采用FC%和FAR%模型验证的准确率和预测力进行评价。

1.9 数据分析

使用SPSS18.0（美国IBM 公司）对模型进行拟合模型，通过Origin9.0（美国OriginLab 公司）绘制生长／非生长曲线，PNN 人工神经网络建立采用MatlabR2016b 进行建模。

2 结果与分析

2.1 腐败希瓦氏菌生长／非生长模型建立

2.1.1 Logistic 生长／非生长模型建立 腐败希瓦氏菌Logistic 回归模型的拟合参数如表2所示。对于二阶线性Logistic 方程，aw、盐分和pH2和aw2的作用对其生长情况有显著影响（P＜0.01），其余参数在计算时差异性不显著，故剔除，腐败希瓦氏菌logistic 生长/非生长模型见式5：

二阶线性logistic 方程：

表2 Logistic 生长/非生长模型拟合参数Table 2 The parameters of the Logistic models

2.1.2 PNN 人工神经网络生长／非生长模型建立采用PNN 人工神经网络模型，建立了腐败希瓦氏菌隐含层数2，输出层神经元1 的PNN 模型。通过随机选取80%的数据训练网络，网络训练最优时间为0.1 s，得到PNN 模型，剩余20%数据再带入PNN 模型进行验证。PNN 网络测试诊断结果显示，30 例验证数据中有26 例数据符合试验情况分类，准确率为86.67%。

2.1.3 两种生长/非生长模型预测效果比较 腐败希瓦氏菌二阶线性logistic 方程训练集和验证集的FC 为93.8%与100%，FAR 分别为6%和0%，R2-Nagelkerke 为0.90，Hosmer-Lemeshow 的χ2=0.64 （P=1，Df=8），R2-Nagelkerke 参数接近1，且Hosmer-Lemeshow 参数值较小，说明该模型拟合优度良好[16，20]。陈琛等[9]利用二阶线性logistic方程建立了环境因子交互作用下蜡样芽孢杆菌生长/非生长模型，结果显示logistic 回归模型拟合优度较高，具有较广的适用范围，可避免对大系数的过度拟合，结果与本研究测试相符。

PNN 人工神经网络模型训练集一致率为100%，验证集FC 为86.67%，但验证集的FAR 比Logistic 模型高出6.25%。PNN 人工神经网络模型能短时间内对生长/非生长数据进行快速分类，且总体准确率较高，但仅能对生长/非生长数据进行分类，无法准确给出生长/非生长界面，仅能输出生长概率0 和1 的数值，即无法给出具体细致的生长概率，但其快速分类功能可为工业生产提供便利。M.Hajmeer[21]对大肠埃希氏菌（Escherichia coli R31）生长/非生长研究显示，同一组内基于PNN 的模型比基于FEBANN （Feedforward error backpropagation artificial neural networks）的模型更精确，且基于二阶logistic 回归模型比线性模型更准确，而处理分类问题时PNN 人工神经网络模型更优。可能由于研究对象的差异，本文基于PNN人工神经网络模型的验证集准确率低于Logistic模型。两种模型拟合优度和预测力比较如表3所示。

表3 两种生长/非生长模型拟合优度和预测力比较Table 3 Comparison of goodness of fit and predictive power of two growth / non-growth models

2.2 环境因子对腐败希瓦氏菌生长概率的影响

2.2.1 盐分对腐败希瓦氏菌生长概率的影响 图1（a～d）为盐分1.0%～4.0%，腐败希瓦氏菌生长概率预测值。图1Logistic 模型预测曲线 （实线）显示：盐分1.0%，aw0.96 和0.94 时，生长概率随pH的增大而增大，最终生长概率达到1；aw0.92 和0.91 时，生长概率在pH 5.2 和6.4 时开始增大，最终生长概率到达1 和0.45；盐分1.0%，aw0.90时，无论pH 如何变化，该交互作用下腐败希瓦氏菌均不生长。虚线为PNN 人工神经网络模型的预测情况，变化趋势与实线近似，生长概率≤0.5 时视作非生长，＞0.5 时视为生长，没有缓慢变化区域，生长概率直接从0 上升到1。aw0.92，pH=5.9处出现拐点，生长概率预测值从0 上升到1。

盐分2.0%时，实线显示aw0.96，0.94 和0.92时，生长概率随pH 增大逐渐增大，最终达到1；aw0.91 时，生长概率从pH 6.5 时开始增大，pH 7时达到1；盐分2.0%，aw0.90 时，无论pH 如何变化，该交互作用下腐败希瓦氏菌均不生长。图1虚线在aw 0.92，pH＜6.5 时预测与实线不完全统一，在pH 6.2 时实线预测的概率＞0.5，但虚线预测仍为0，其差别原因可能是由于2 种建模方式的个体差异、训练集数据的选取差异等造成的。

盐分3.0%和4.0%时，实线显示aw 0.91 时，生长概率分别在pH 6.7 和6.9 时开始增大，最终到达0.06 和0.02。盐分越高，pH 与aw 的交互作用逐渐加强，腐败希瓦氏菌不适宜生长，生长界限开始变化点趋于高pH 范围，高盐分对腐败希瓦氏菌有生长抑制作用，其趋势与虚线相同。

图1 2 种模型盐分作用下腐败希瓦氏菌生长概率预测值Fig.1 The influence of the growth probability of Shewanella putrefaciens by salty with two models

修艳辉等[5]对环境单因子对腐败希瓦氏菌生长/非生长界限做了研究，表明25 ℃时生长概率随盐分的增加而逐渐降低，当盐分≥12%时腐败希瓦氏菌均不生长，与本研究结果趋势相符，但由于其为单因素试验故有一定差异。研究显示[22]Shewanella amazonensis 细胞膜成分变化可能是高NaCl 胁迫的间接生理响应，当NaCl 为9.35%时，生长速率被抑制至原来的50%。随着盐分的增长，腐败希瓦氏菌生长受到抑制，生长界限向高pH、高aw 方向偏移；aw≤0.91 时，均不生长。

2.2.2 aw 对腐败希瓦氏菌生长概率的影响 图2（a～d）中logistic 模型预测曲线（实线）为腐败希瓦氏菌，aw 对腐败希瓦氏菌生长概率影响预测值。aw0.90 时，该交互作用下腐败希瓦氏菌均不生长。aw0.91 时，盐分1.0%～4.0%条件下，生长概率在pH=6.4，6.5，6.7 和6.9 时开始增大，最终生长概率分别达到0.45，0.19，0.06 和0.02，该交互作用下腐败希瓦氏菌生长概率很低，生长基本受到抑制。aw0.92，0.94 和0.96 时，生长概率受盐分影响逐渐减小，随pH 增大而增大，生长概率上升变化陡峭。aw 越高，pH 与盐分的交互作用就被减弱，腐败希瓦氏菌越适宜生长。

图2中PNN 人工神经网络预测结果（虚线），与Logistic 模型预测曲线结果相似，生长/非生长0，1 分界点在Logistic 模型预测曲线中位于生长概率0.5 附近，将生长概率＜0.5 的情况视作不生长，无法观测到水分活度0.91 时，pH 大于6.5 之后的生长概率变化，实际生长概率有小幅上升趋势。aw0.92 时，盐分1%～4%条件下，分别在pH=6.0，6.3，6.4，6.5 处出现拐点，生长概率预测值由0变为1；aw0.94，0.96 变化趋势与实线相似。

aw 反映水分与食品结合程度，是微生物酶和化学反应能触及的水分，是微生物生长繁殖的重要因素[23]，学者[24]利用山鸡椒油改变产品aw，显示浓度越高腐败菌抑菌圈直径越大，且破坏细胞结构，抑制糖类和蛋白质的消耗，抑制琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活性，需要对aw 对腐败菌生长抑制机制进行深入研究。

图2 2 种模型下aw 对腐败希瓦氏菌生长概率影响预测值对比Fig.2 The influence of the growth probability of Shewanella putrefaciens by water activity under two models

2.2.3 pH 值对腐败希瓦氏菌生长概率的影响图3（a～f）为pH=4.5～7.0 时，腐败希瓦氏菌生长概率影响预测值。图中实线为Logistic 模型预测的生长/非生长曲线，其中pH 4.5 时，腐败希瓦氏菌的生长受到强烈抑制。pH 5.0 时，aw=0.96 且盐分≤3%生长概率大于0.5。pH 5.5 时，aw0.96，0.94 时，随盐分增长腐败希瓦氏菌生长概率从1.00 下降到0.86，其余水分活度均不生长。pH 6.0 时，aw＞0.92 条件下生长概率均为1，aw0.92 条件下，生长概率随盐分增大而下降，aw＜0.92 条件下均不生长。pH 6.5 与7.0 时，随盐分的增大腐败希瓦氏菌的生长概率在aw0.92 与0.91 时逐渐递减。图3（a～f）虚线为PNN 神经网络预测曲线，与logistic模型预测曲线结果相似，但无法表示生长概率变化的范围及过程，仅可显示拐点。pH 5.0，aw=0.96，盐分3%时以及pH 6.5，aw=0.92，盐分4%为生长概率预测值拐点，生长概率从1 变为0。

Jung-HoonYoon 等[25]研究显示希瓦氏菌属最适生长pH 值在7.0 到8.0 之间，与本研究结果一致。研究[26]表明pH 变化会影响腐败希瓦氏菌表面超微结构，改变扬氏模量和细胞弹簧常数，pH 减小会导致细胞壁厚度变小，破坏细胞膜完整性。在生产过程中可适当添加有机酸调节pH，其抑菌机理包括能量竞争、透化细菌外膜、提高胞内渗透压、抑制生物大分子合成和诱导宿主产生抗菌肽等作用[27]，腐败希瓦氏菌生长概率随pH 减小而减小，其生长概率作用机理有待深入研究。

3 结论

1）建立了腐败希瓦氏菌二阶线性Logistic 模型和PNN 人工神经网络模型来预测其生长/非生长情况。二阶线性logistic 模型和PNN 人工神经网络模型的训练集一致率分别为93.80%和100.00%，验证集一致率分别为100.00%和86.67%。PNN 网络能对生长/非生长数据进行快速分类，但二阶线性logistic 模型能更好的反映腐败希瓦氏菌的生长概率预测，生长/非生长模型为：

图3 2 种模型下pH 对腐败希瓦氏菌生长概率影响预测值对比Fig.3 The influence of the growth probability of Shewanella putrefaciensby pH under two models

logit（P）=-9 847.799+20 712.603×aw-1.237×NaCl+0.567×pH2-10 901.375×aw2

2）随着盐分增长，腐败希瓦氏菌生长/非生长界限小幅度向高aw，高pH 方向移动，高盐分对腐败希瓦氏菌有生长抑制作用。aw≤0.91 时，菌株均不生长，aw=0.92，0.94 和0.96 时，腐败希瓦氏菌生长概率随pH 增大而增大，上升变化陡峭。pH=4.5 时，腐败希瓦氏菌基本不生长，随pH 升高，高aw 情况下的生长概率先增长到1。