超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术非靶向筛查涪陵地区有机污染物

许 惠，汪 贞，古 文，周林军，范德玲，张 志，刘济宁②

(1.黑龙江大学农业资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨 150000；2.生态环境部南京环境科学研究所，江苏 南京 210042)

利用静电场轨道阱高分辨质谱(Orbitrap-HRMS)技术，通过频率测量质荷比的方式，可以得到超高分辨率碎片离子的精确质量[1]，具有在超高分辨率条件下测定环境污染物精确相对分子质量的功能，借助同位素离子的丰度比来推断有机污染物元素组成，通过一级、二级谱库的匹配对复杂基质中未知组分进行筛选和确证[2]。在国外，四级杆/静电场轨道阱-质谱(Q Orbitrap-MS)的应用主要集中于水样中某一类化合物的筛查与鉴定[3]，而药品、个人护理品及食品领域也有所涉及[4]。CASADO等[5]利用液相色谱-Q Orbitrap高分辨率串联质谱法开发了一种用于测定地表水样品中250多种农药残留的定量方法并进行验证；MUZ等[6]建立了针对环境样品中芳香胺类化合物的液相色谱-高分辨质谱非靶向检测和鉴定方法，并将其成功用于废水样品检测，筛选和鉴定得到几种新型芳香胺衍生物；HUG等[1]建立了基于液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)逐步识别化合物的筛选程序，通过对废水样品的检测和分析，确定了6种疑似目标物和5种非目标化合物，发现2种未曾报道的环境污染物；KNOLHOFF等[7]将液相色谱与高分辨质谱联用技术应用于食品安全分析领域，并检测和识别出食品基质中存在的有机污染物。PARK等[8]使用LC-HRMS(QExactive plus Orbitrap)对韩国Yeongsan River中药品和个人护理产品(PPCPs)进行优先排序和定量分析以确定高暴露的PPCPs种类。而在国内，Orbitrap高分辨质谱技术主要应用于药物及毒品的检测与分析，近年来在水样及水产品污染物检测中也有应用。张宪臣等[9]利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法(UPLC-Q Orbitrap HRMS)的同时定性定量功能，建立了水产品中25种药物残留的检测方法。

目前国内外针对环境污染物检测的相关研究中，UPLC-Q Orbitrap HRMS的应用主要集中于对某一类化合物的定性筛查与定量分析[10]。而该研究借助UPLC-Q Exactive Orbitrap/HRMS+ Compound Discoverer 3.0软件，对某地区多种环境样本中未知化合物进行有效快速筛查，同时对相对高暴露风险化合物进行定量分析，从而建立环境中未知化合物的高通量非靶向筛查策略，为有机污染物的识别与定量分析提供了新的技术方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000 UPLC system(美国Thermo Fisher公司)；Q-Exactive Focus Orbitrap mass spectrometry(美国Thermo Fisher公司)，配有电喷雾离子源(HESI)；Hypersil Gold C18色谱柱(50 mm × 2.1 mm × 1.9 μm，美国Thermo Fisher公司)；固相萃取装置(美国Supeco公司)；固相萃取柱Oasis HLB 150 mg/6 mL(美国Waters公司)；固相萃取柱Oasis WAX 150 mg/6 mL(美国Waters公司)；固相萃取柱Oasis WCX 150 mg/6 mL(美国Waters公司)；旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；氮吹浓缩仪(美国Zymark公司)；0.2 μm GHP膜针头式过滤器(美国Waters公司)；0.45 μm玻璃纤维滤膜(美国Millipore公司)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)；涡旋混合器(日本LMS公司)；GM-0.33A真空泵(中国津腾公司)。

甲醇、乙腈和乙酸乙酯(德国Merck公司)均为色谱纯；氨水和甲酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)为色谱纯；实验用水为由超纯水机(美国Millipore公司)制备的去离子水(电阻率为18.2 MΩ·cm)。

实验所用14种标准品(纯度以质量分数表示)：2-硝基-4-氨基苯酚(5 g，95%)，双酚B(1 mL，10 mg·mL-1)，二甲戊灵(1 mL，100 μg·mL-1)，茴茚二酮(5 g，95%)，4,4′-二羟基二苯甲烷(1 mL，10 mg·mL-1)，对叔戊基苯酚(1 kg，99%)，4-仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚(25 g，98%)，2-叔丁基-4-乙基苯酚(10 g，95%)，克拉屈滨(25 mg，99%)，雌酮(1 g，99%)，雌三醇(1 g，98.5%)，螺内酯(1 g，95%)，尼莫地平(1 g，99%)，扑米酮(5 g，99%)，均购自上海百灵威科技有限公司。

1.2 色谱和质谱参数

色谱条件：Hypersil Gold C18色谱柱(50 mm × 2.1 mm ×1.9 μm)；柱温为40 ℃。正离子模式：流动相A为φ=0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；负离子模式：流动相A为φ=0.05%氨水，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：0～2 min，90%A；2～3 min，90%～70%A；3～6 min，70%～50%A；6～9 min，50%～40%A；9～15 min，40%～0%A；15～23 min，0% A；23～23.5 min，0%～90%A；23.5～25 min，90%A。流速均为0.3 mL·min-1；进样体积为5 μL。

质谱条件：电离方式为电喷雾离子源，离子源温度为375 ℃，离子喷雾电压为3 500 V，鞘气流速为40 arb，辅助气为10 arb，反吹气为0，S-lens RF 为 50；辅助气压：10 arb，喷雾气和碰撞气均为氮气，扫描方式采用 Full MS/ddMS2+Discovery，正离子模式和负离子模式下分别进样，此模式包含分辨率为70 000 的一级全扫描和数据依赖的分辨率为17 500的二级扫描，扫描范围为100～1 500m/z，一级扫描自动增益控制设为1.0e6，离子注入时间设为100 ms；数据依赖的二级扫描自动增益控制设为1.0e5，最大离子注入时间设为100 ms，隔离窗口设为3.0m/z，碰撞能量设为40 eV，Loop count设为3，动态排除设为10.0 s。

1.3 样品采集

调查采样工作于2018年11月开展。根据涪陵地区的地形与水文特征，参考《水和废水监测分析方法》(第4版)[11]采样点布设原则，共设置13个水样采样点(W1～W13)和5个沉积物采样点(E1～E5)，其中，沉积物采样点位置分别对应水样采样点W1、W2、W6、W7和W11；此外，布设6个土壤采样点(S1～S6)，采样点分布见图1。

图1 采样点分布

水样采集：采用5 L采水器采集，每次采样前用采样现场的地表水冲洗采水器3～4次，冲洗后使用采水器采集水面以下50 cm水样1 L于棕色玻璃广口瓶中。采集的水样用6 mol·L-1盐酸溶液调节pH至2～4以抑制水样中细菌的繁殖生长，并在24 h内运回实验室，于2 ℃条件下遮光保存直至实验分析。土壤样品：在布点处采集5～20 cm表层土壤，充分混匀后取样，各采样点采集1 kg土壤放入铝箔袋密封遮光保存。沉积物样品：采用抓斗式采泥器采集，各采样点采集0.5 kg沉积物，装入带盖不锈钢铝盒中低温保存，在24 h内运回实验室，并于1周内完成检测。

1.4 样品前处理方法

水样：将预先用盐酸调节pH=2～4的水样过0.45 μm孔径玻璃纤维滤膜，准确量取滤液500 mL，过预先用甲醇活化的Oasis HLB 6cc小柱，上样速度约为5 mL·min-1。上样后，用10 mL超纯水淋洗HLB小柱，并在负压条件下抽真空30 min使其干燥，用10.0 mL甲醇洗脱，洗脱液经氮气吹至近干，然后用甲醇定容到1 mL，涡旋振荡1 min，待UPLC-HRMS分析。

土壤样品：取出研磨至粉末状的干燥土壤5.0 g，分别用25 mL乙腈超声提取2次，每次15 min，合并2次提取液后旋转蒸发至近干，氮气吹干后用1 mL甲醇溶解，涡旋振荡1 min，过0.22 μm有机滤膜后待UPLC-HRMS分析。

沉积物样品：将沉积物样品冷冻干燥后取出研磨至粉末状，称取5.0 g粉末状样品，之后的处理方法同土壤样品。

1.5 环境样品中有机污染物非靶向筛查分析策略

非靶向筛查分析策略分为样品中潜在污染物的定性筛查和对暴露风险高的若干种污染物进行定量分析2个阶段。

阶段1分4步完成：(1)潜在有机污染物全扫描原始数据的获得。包括利用Oasis HLB 150 mg/6 mL固相萃取柱对潜在有机污染物进行提取，利用UPLC-HRMS对样品进行full scan + data dependence MS2 模式扫描。(2)全扫描源数据的解析。利用Compound Discoverer 3.0软件(美国Thermo Fisher公司)对原始数据进行解析。解析结果经人工二次整理和筛选后，获得潜在污染物列表。(3)根据污染物最大峰面积、检出频率和mzCloud匹配打分对列表中化合物进行初步暴露性评估赋分。(4)基于污染物种类将列表中化合物进行分类，并根据各类化合物的总峰面积制作污染物浓度分布图以研究污染来源及分布情况。

阶段2分2步完成：(1)选择前述列表中暴露风险高的污染物，采用外标法定量分析。(2)基于定量结果对污染物种类、来源和污染程度进行分析，验证方法的可靠性。

2 结果与分析

2.1 Compound Discoverer非靶向筛查结果

采用Compound Discoverer 3.0软件进行非靶向筛查。基于MS/MS相似性搜索算法，从在线mzCloud数据库(包含8 450种化合物2 913 613 张谱图)中获得最相似的谱图，从而获得相应的碎片结构信息，结合结构相似性算法，对候选化合物进行智能排序打分。按照一级母离子质量数偏差小于5×10-6、保留时间偏差小于0.2 min、同位素匹配阈值在30%范围内的要求查找类似物，按峰面积大于1×105且配对分数(score)大于85的要求进行筛查。

结合Compound Discoverer 3.0软件匹配结果、相对峰面积和检出率，涪陵地区环境样品中共初步筛选出137种污染物。137种污染物包含55种塑料添加剂(邻苯二甲酸酯类、双酚类等)、44种PPCPs(处方药和非处方药、兽药等)和38种农药(苯胺类除草剂、三唑类杀菌剂等)，分别占所有污染物种类的40.15%、32.12%和27.74%。

检出频率能够反映某一有机污染物的分布情况，检出浓度代表某一有机污染物的污染水平，根据Compound Discoverer 3.0软件匹配结果得分确定化合物具体的物质结构信息，进而结合统计学分析，将最大峰面积大于1×108的有机污染物赋值100分，大于1×107则赋值90分，分值依次按数量级递减而递减，分别将软件匹配结果、检出频率和相对峰面积各赋值100分[8]，总分300分。得分排序结果见表1。

表1 14种高暴露风险有机污染物赋分情况汇总

Table 1 Summary of the 14 high-exposure risk organic matter pollutants

序号CAS相对分子质量分子式物质名称类别检出率/%CD赋分1)峰面积赋分总分1119-34-6153.030 57C6H6N2O32-硝基-4-氨基苯酚PPCPs(医药中间体)7999.5100279277-40-7241.123 40C16H18O2双酚B塑料添加剂9695.2100291340487-42-1280.130 28C13H19N3O4二甲戊灵农药 8895.71002844117-37-3253.085 92C16H12O3茴茚二酮PPCPs(医药中间体)8399.71002835620-92-8199.076 45C13H12O24,4′-二羟基二苯甲烷塑料添加剂8399.2100282680-46-6163.112 84C11H16O对叔戊基苯酚PPCPs(医药中间体)8396.5100280717540-75-9261.222 39C18H30O4-仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚PPCPs(医药中间体)7199.2100270896-70-8177.128 49C12H18O2-叔丁基-4-乙基苯酚PPCPs(医药中间体)6796.210026394291-63-8284.055 59C10H12ClN5O3克拉屈滨PPCPs(药物类)6399.21002621053-16-7269.154 70C18H22O2雌酮PPCPs(药物类)6099.81002601150-27-1287.165 27C18H24O3雌三醇PPCPs(药物类)7890.81002691252-01-7417.209 41C24H32O4S螺内酯PPCPs(药物类)7099.01002691366085-59-4419.181 28C21H26N2O7尼莫地平PPCPs(药物类)7890.310026814125-33-7217.098 25C12H14N2O2扑米酮PPCPs(药物类)6399.5100263

1)指Compound Discoverer 3.0软件赋分。

由表1可知，双酚B、二甲戊灵、茴茚二酮、4,4′-二羟基二苯甲烷和对叔戊基苯酚总分≥280分，2-硝基-4-氨基苯酚、4-仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚、2-叔丁基-4-乙基苯酚、克拉屈滨、雌酮、雌三醇、螺内酯、尼莫地平和扑米酮总分均在260分以上，这14种污染物是定性结果准确、潜在暴露风险相对较高的主要污染物。因此，对这14种污染物进行外标法定量并分析其可能来源。

2.2 涪陵地区环境样品中有机污染物的种类及源解析

137种污染物主要分为PPCPs、农药、塑料添加剂3类。根据水样中不同污染物在不同点位检出水平的对比分析(图2)可知，农药污染主要覆盖在长江段W9、W10、W11和W12区域，W11点位农药检出水平最高，其他点位均有少量检出，总体上从上游到下游呈下降趋势，农药的污染来源可能是由于周围农田施用所致。W2、W8、W9、W11和W12处PPCPs检出水平较高，其中，W8处检出水平达到最大值，W8～W11区域周围人口密集是PPCPs检出水平较高的可能原因。而涪陵化工园区内食品加工包装、医药、电子和化工行业的聚集是水样中塑料添加剂普遍检出的主要原因。在乌江涪陵段主要污染物为塑料添加剂，并且检出水平呈从上游随水流方向下降趋势，长江和乌江交汇处W7点位污染物检出水平较低。

图2 水样中检出物质的分布特征

对于土壤和沉积物样品，PPCPs检出水平较低，主要污染物为农药和塑料添加剂(图3)。在S1～S6点位农药检出水平普遍较高，与水样中农药检出规律相似，很可能是周围农田施药所致。在乌江附近白涛化工园区S4、S5和S6点位，土壤中塑料添加剂检出水平也较高，说明化工加工产业是塑料添加剂类污染物的主要来源。对于沉积物样品中塑料添加剂，从乌江上游随着水流方向呈明显下降趋势。

S1～S6为土壤采样点，E1～E5为沉积物采样点。

2.3 涪陵地区高暴露有机污染物浓度水平及源解析

基于匹配程度、相对峰面积和检出率综合排序，对总分≥260分的14种化合物(水样12种，土壤和沉积物8种，6种重复)进行定量分析，并验证化合物结构，结果表明谱库匹配分析结果正确。

2.3.1水样中有机污染物浓度水平及源解析

根据水样中各有机污染物的检出率、检出浓度和Compound Discoverer 3.0软件得分情况，选取2-硝基-4-氨基苯酚(A)、双酚B(B)、二甲戊灵(C)、茴茚二酮(D)、4,4′-二羟基二苯甲烷(E)、对叔戊基苯酚(F)、克拉屈滨(G)、雌酮(H)、雌三醇(I)、螺内酯(J)、尼莫地平(K)和扑米酮(L)12种有机污染物进行定量分析。

3类有机污染物在涪陵地区的分布呈现明显规律性。除扑米酮外，其余11种污染物在13个采样点分布水平的总体趋势基本一致。12种有机污染物包括9种PPCPs(茴茚二酮、克拉屈滨、雌酮、雌三醇、螺内酯、尼莫地平、扑米酮、2-硝基-4-氨基苯酚和对叔戊基苯酚)、2种塑料添加剂(双酚B和4,4′-二羟基二苯甲烷)和1种农药(二甲戊灵)。图4显示，PPCPs类污染物质量浓度范围为9.11～67.61 ng·L-1，其中，克拉屈滨、雌三醇和螺内酯质量浓度较高，分别为67.61、32.98和26.96 ng·L-1，并且在W8、W9、W11、W12这4个采样点的平均浓度明显高于其他采样点，与筛查分析结果基本一致。农药类污染物仅对二甲戊灵进行定量分析，检测质量浓度范围为42～286 ng·L-1，检出率为88%，但质量浓度平均值达到118.08 ng·L-1，已超过欧盟规定的水环境中单个农药的最低限值(0.1 μg·L-1)[5]。2种塑料添加剂(双酚B和4,4′-二羟基二苯甲烷)质量浓度平均值相对较低，分别为14.18和12.98 ng·L-1，检出率分别为98%和86%，各个采样点浓度水平相差不大。扑米酮仅在W10和W11样点呈高水平分布，检测质量浓度分别为118.7和117.3 ng·L-1，但检出率仅为16.67%，其余采样点均无检出，呈点源污染特性。

2.3.2土壤和沉积物样品中有机污染物含量水平及源解析

与水样的赋分规则相同，选取土壤和沉积物样品中8种有机污染物进行定量分析，其中6种与水样相同。8种有机污染物〔2-硝基-4-氨基苯酚(A)、双酚B(B)、二甲戊灵(C)、茴茚二酮(D)、4,4′-二羟基二苯甲烷(E)、对叔戊基苯酚(F)、4-仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚(M)和2-叔丁基-4-乙基苯酚(N)〕包括5种PPCPs、2种塑料添加剂和农药二甲戊灵。其中，土壤中PPCPs类污染物质量分数范围为ND～3.6 ng·g-1，沉积物中质量分数范围为ND～2.5 ng·g-1，各个采样点的含量差异不大。农药类污染物分布特征与水样相似，但二甲戊灵含量水平远高于其他污染物，土壤中最大值为30.9 ng·g-1，平均值为22.15 ng·g-1；沉积物中最大值为27 ng·g-1，平均值为16.88 ng·g-1，应是农药施用所致。2种塑料添加剂(双酚B和4,4′-二羟基二苯甲烷)的分布趋势与筛查分析结果基本一致，在S2处为最大值，SE1、SE2处也呈高浓度分布，土壤中质量分数范围为ND～1.8 ng·g-1，沉积物中质量分数范围为0.4～1.2 ng·g-1，平均值分别为0.79和0.8 ng·g-1，检出率分别为80%和94%(图5)。

A为 2-硝基-4-氨基苯酚，B为双酚B，C为二甲戊灵，D为茴茚二酮，E 为4,4′-二羟基二苯甲烷，F为对叔戊基苯酚，G为克拉屈滨，H为雌酮，I为雌三醇，J为螺内酯，K为尼莫地平，L为扑米酮。

A为 2-硝基-4-氨基苯酚，B为双酚B，C为二甲戊灵，D为茴茚二酮，E 为4,4′-二羟基二苯甲烷，F为对叔戊基苯酚，M为 4-仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚，N 为2-叔丁基-4-乙基苯酚。S1～S6为土壤采样点，E1～E5为沉积物采样点。

3 讨论

笔者研究发现，PPCPs、农药、塑料添加剂这3类有机污染物在水环境中普遍被检测到。涪陵地区处于长江与乌江交汇处，属于长江上游地区。水环境、土壤和沉积物中共检测出55种塑料添加剂、44种PPCPs和38种农药，分别占所有有机污染物的40.15%、32.12%和27.74%，其中，邻苯二甲酸酯类是塑料添加剂中主要污染物类别，这与许艳秋[12]对同属长江上游的嘉陵江中主要污染物的筛查及分类结果相似。但根据检出频率、峰面积综合赋分排序筛选后得到的14种高暴露风险污染物中，PPCPs占很大比例。高暴露水平的9种PPCPs质量浓度范围为ND～118.7 ng·L-1，其中，克拉屈滨和雌三醇质量浓度尤其高，平均值分别为67.61和32.98 ng·L-1，检出率分别为99.2%和99.0%。国外报道巴西某水库中检测到6种PPCPs，质量浓度范围为ND～1 192.39 μg·L-1，平均值为170.87 μg·L-1，检出频率为100%[13]。李钟瑜[14]对上海市2条河流水样的检测结果显示，6种PPCPs质量浓度检出范围为6.56～302 ng·L-1。刘娜等[15]对太湖流域的检测分析显示，太湖水体中定性检出PPCPs类化合物33种，其中，17种在定量检出限以上，质量浓度范围为 0.03～25.77 ng·L-1。可以看出，尽管同属于长江流域，不同地区PPCPs浓度水平差距较大。笔者研究中水体中塑料添加剂质量浓度范围为5.6～36.9 ng·L-1。

由图4～5可知，在不同采样点，塑料添加剂浓度差异不大，这可能取决于当地的水体排放量和河流的稀释作用[16]，更主要的是由于涪陵地区地处长江与乌江交汇处，各个采样点附近的地理环境和社会环境相似，这也在一定程度上导致塑料添加剂类污染物基本处于同一水平。郭志顺等[17]对重庆三峡库区蓄水后水体中增塑剂质量浓度的检测分析结果为≤0.957 μg·L-1。太湖入湖河流和出湖河流中增塑剂质量浓度分别为222.6～2 934.2和340.1～1 529.2 ng·L-1[16]。相比较而言，涪陵地区两江水体中塑料添加剂浓度水平较低，这应与两江流量大而稀释作用强、人口密集度相对较低且人类活动相对较弱有关。对于苯胺类除草剂二甲戊灵，在水体、土壤和沉积物中平均浓度分别为118.08 ng·L-1、22.15 ng·g-1和16.88 ng·g-1，应为当地农业生产施药所致。

4 结论

目前在环境有机污染物分析方面，研究者通常采用针对某一类目标物的分析方法。建立针对特定区域的高效快速的未知物非靶向筛查策略，对于全面分析研究环境污染状况具有重要参考价值。该文采用UPLC-Q Orbitrap HRMS对环境中弱极性至极性有机污染物开展非靶向筛查，涪陵地区环境样品中初步筛查发现137种有机污染物；选取相对丰度和检出率较高的14种污染物采用外标法进行定量分析，取得了满意结果。

从该研究的定性筛查分析结果中可以看出，筛选得到的污染物主要为弱极性至极性类化合物，未发现非极性类化合物。对于环境样品中非极性污染物的非靶向筛查，尚需进行更深入的研究。