高通量测序技术在新生儿地中海贫血基因筛查中的应用

罗桂香，李恋湘，周颖娟，李磊

（珠海市妇幼保健院，广东 珠海 519001）

目前，虽然医疗卫生事业得到了极大的提升，使得多种疾病得到了良好的治疗，但依然存在着各类疑难杂症，其中以先天性疾病最具代表性。地中海贫血便是新生儿先天性缺陷的一种，在该先天缺陷的影响下，使得患儿于刚出生便存在着严重的发育不良、贫血、黄疸等临床症状，治疗难度大。据相关调查表明，该疾病多发于东南亚各地区，我国较少，主要为两广及海南等地。地中海贫血主要是因为新生儿体内因地中海贫血基因的存在而出现严重的基因缺陷，对患儿体内本应正常合成的珠蛋白链产生影响。由于地中海贫血对新生儿的伤害极大，且治疗困难，因此，要秉承着早发现、早预防、早治疗的理念，当前，高通量测序技术对地中海贫血基因的筛查准确率较高，且筛查范围、准确率、便捷性均明显优于传统常规筛查法。本文围绕高通量测序技术在地中海贫血基因筛查中的检测效能进行了详细分析。本研究使用下一代测序技术（next generation sequencing technology，NGS）对样本进行地贫基因检测，通过生物信息学分析，分析地贫基因点突变和缺失等信息。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本次对照实验中，地中海贫血阳性者共219例，均为2018年9月-2019年6月期间在我院接受产前检查的孕妇，入组前，孕妇及其家属已同意参与本次实验，并已在相关知情同意书中签字，研究对象中不存在各类慢性疾病、血液型疾病及精神类病史。219例阳性孕妇中，最小年龄21岁，最大年龄37岁，平均年龄（31.25±2.09）岁。

1.2 方法 用EDTA抗凝管采集研究对象外周血，每人两管，每管约3 mL，分别用于常规地中海贫血基因检测和高通量测序地贫基因筛查[1]。

1.2.1 常规筛查 采用跨越断裂点的PCR（gap-PCR）[2]进行检测，基因检测试剂盒（深圳益生堂技术有限公司）进行基因诊断，检测4种缺失型（-SEA、-α3.7、-α4.2和-αTHAI）α-地中海贫血。采用反向点杂交（RDB）技术[3]，检测3种非缺失型（HbWS、HbCS、HbQS）地贫和17种（包括-28M、41-42M、654M、14-15M、71/72M、-29M、31M、CAP、32M、17M、43M、27/28M、βEM、IVS1-1M、IVS1-5M、IntM、30M）β-地中海贫血。并由专业人员详细记录检查数据[4-6]。

1.2.2 高通量测序 在样本采集完毕后将进行储存，检查无误后对样本进行DNA提取、纯化及质量鉴定，然后进行文库构建和定量检测。然后采用BGISEQ500测序平台，采用双端测序的方式进行基因组测序，然后进行生物信息学分析。

1.3 观察指标 观察指标使用两种检测方法的阳性检出率，若检查结果为阴性，则不计入检测准确例数中，在检查完成后，还需要使用Sanger进行验证。

1.4 统计学处理 实验过程中，需要对数据进行分析处理，应用SPSS 23.0软件分析，计数资料以例和百分率表示，行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

采用高通量测序技术进行检测，准确检测出217例，误诊2例，准确率99.08%；而对孕妇实行常规筛查检测，准确检出168例，准确率76.71%。由此可见，高通量测序技术的准确率较高，且明显高于常规筛查，数据间差异具有明显可比性，研究组基因检测准确率明显高于参照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两种地中海贫血基因检测方式的检测准确率对比

3 讨论

近年来，地中海贫血的发病率在不断提高，导致人民的生活水平受到了较大的影响。地中海贫血又被称为珠蛋白生成障碍性贫血或者海洋性贫血，其发病原因多为遗传所致，新生儿体内存在地中海贫血基因，在该基因的影响下，新生儿的珠蛋白生成出现障碍，给新生儿的生长发育造成了严重伤害，若没有及时发现并给予针对性的防治，极有可能在出现黄疸、发育不良等临床症状[7]。

患有地中海贫血的新生儿因其地中海贫血基因的不同有着较多的临床表现，但一般主要可以分为轻型、中间型及重型。轻型的地中海贫血，其症状极为浅显，不能通过常规检查方法准确检测出，中间型地中海贫血症状相对比较严重且个体变异度较大。若新生儿的地中海贫血为重型，难免刚出生伊始，其机体便会出现严重的病理特征，一般常见症状为发育不良、黄疸等，但极有可能会因其地中海贫血基因型的不同而出现头大、臀状头、马鞍鼻等多种病理情况。患者多采用红细胞输注、脾切除、造血干细胞抑制异基因、基因活化治疗等多种方法进行治疗[8]。

目前常见地中海贫血基因检测方法主要有常规检测方法及高通量测序技术，据实际应用结果来看，使用在跨越断裂点PCR的常规检测方法能够涵盖的地中海贫血基因类型较少，仅能够检测出比较常见的α-地中海贫血和β-地中海贫血。且检测方法的操作相对较繁琐，因此局限性较大。与常规检测方法相比，高通量测序技术在检测范围、准确率方面有着较大的提升，且一次性最多检测量高达338例，一度成为地中海贫血基因筛查中最便捷的方法。

在高通量测序技术应用于地中海贫血基因检测时，可以在扩增检查样基因后结合Gap-PCR技术进行双向检验，若样本DNA中存在缺失型和突变型也能够准确检测出，大大提高了检测准确率，此外，高通量测序技术中，最为重要的时期“高通量”，能够一次性检测数量庞大的DNA样本，同时，该技术早已应用了现代化信息技术、智能化技术及自动化技术，可以通过特定程序自动化操作，与常规检测方法中的人工操作相比，便捷性、误诊率方面有较大的差异。由于地中海贫血对患儿身体的伤害较大，且治疗难度极大，因此应以预防为主，通过使用高通量测序技术来进行产前筛查，效果甚佳。

据本次实验结果来看，通过对219例孕妇采用高通量测序技术进行检测，准确检测出217例，误诊2例，准确率99.08%；而对孕妇实行常规筛查来进行检测，准确检测出168例，准确率76.71%。高通量测序技术的检查准确率明显高于常规筛查（P＜0.05）。由以上表述来看，对产前孕妇使用高通量测序术进行地中海贫血基因检测的应用价值高，适宜推广。