基于HPLC-ELSD对浙贝母功效成分地理变异的研究

2020-04-02张晓芹吕虹艳蓝艳陈礼平

中国医药导报 2020年3期

张晓芹吕虹艳蓝艳陈礼平

[摘要] 目的探讨浙贝母的功效成分地理变异情况及其形成的原因。方法采用Kromasil ODS C18色谱柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.03%二乙胺水，流速为1 mL/min，柱温40℃;运用SPSS 20.0软件进行数据分析。结果丽水市云和县龙埠村（LS-YH-LB）贝母素甲、乙的总含量最高;14个产区的贝母素甲含量高于贝母素乙，5个产区贝母素乙含量高于贝母素甲;聚类分析中，LS-YH-LB、温州市乐清市盛家塘村等8个高含量产区聚为一类，其他产区聚为一类。结论浙贝母中功效成分存在明显的地理变异现象，暗示不同产区浙贝母存在一定的质量差异。本研究为浙贝母规范化化种植及进一步开发利用提供参考依据。

[关键词] 浙贝母;功效成分;形成原因;道地产区

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2020）01（c）-0110-05

Quantification of chemical compositions in Fritillaria thunbergii from different geographical origin by HPLC-ELSD

ZHANG Xiaoqin LYU Hongyan LAN Yan CHEN Liping

Department of Pharmaceutical， Lishui Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhejiang Province， Lishui 323000， China

[Abstract] Objective To investigate the contents of the functional components in Fritillaria thunbergii from different geographical locations. Methods Kromasil ODS C18 column （200 mm × 4.6 mm， 5 μm） column was used as the column， acetonitrile-0.03% diethylamine was used as the mobile phase， the flow rate of 1.0 mL/min. The colomn temperature maintained at 40℃. Multivariate statistical analysis was carried out by SPSS 20.0. Results The total contents of verticine and verticinone were the highest in Longbu village， Yunhe county， Lishui city （LS-YH-LB）. The content of verticine was higher than that of verticinone in 14 producing areas， and the verticinone was higher than that of verticine in 5 producing areas. In the cluster analysis， eight high-content producing areas， such as LS-YH-LB and Leqing city， Wenzhou city， were grouped into one category， while other producing areas were grouped into one category. Conclusion There are obvious geographical variations in the functional components of Fritillaria thunbergii， which indicats that there are some quality differences in different producing areas of Fritillaria thunbergii. This study provides reference for the standardized planting and further development and utilization of Fritillaria thunbergii.

[Key words] Fritillaria thunbergii; Chemical compositions; Cause of formation; Genuine producing area

[基金項目] 浙江省卫生计生委中医药科技计划项目（2015Z A229）;浙江省丽水市重点科技创新团队建设项目（2018cxt d06）;浙江省基础公益研究计划项目（LGF19H280002）。

浙贝母为百合科（Liliaceae）植物浙贝母（Fritillaria thunbergii）的干燥鳞茎，具有化痰止咳、清热散结之功效，生物碱为其化痰、止咳的主要成分[1-2]。不同产区浙贝母中总生物碱含量和指纹图谱均存在一定的差异[3-7]。针对贝母素甲、贝母素乙的含量而言，是否存在明显的地理变异规律及其形成的原因很少有人研究。阐明浙贝母功效成分的地理变异规律，对于指导高质量浙贝母的规范化种植、提高浙贝母临床疗效稳定性具有重要的意义。

本研究在前人研究基础上[8-9]建立了浙贝母中贝母素甲、乙的HPLC-ELSD的含量测定方法，并对27个产地的浙贝母样品进行含量测定，分析浙贝母功效成分地理变异的规律性，探讨了浙贝母传统道地产区药材质量与现代种植产区药材质量的差异，为浙贝母规范化种植及临床应用提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），Altech ELSD 2000检测器，XS105DU电子天平（万分之一，瑞士梅特勒公司），KQ5200D超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FW100型高速万能粉碎机（上海隆拓仪器设备有限公司）。

1.2 试剂

甲醇（分析纯，杭州高晶精细化工有限公司）;乙腈（色谱纯，Spectrum Chemical Mfg.Corp.）;氯仿（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;贝母素甲标准品（批号：110750-201612，中国食品药品检定研究院）;贝母素乙标准品（批号：110751-201611，中国食品药品检定研究院）。

1.3 实验样品

样品信息见表1，由丽水市中医院林娜副主任中药师鉴定为百合科植物浙贝母（Fritillaria thunbergii）。

表1 样品采集信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Kromasil ODS C18色谱柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为A乙腈，B 0.03 % 二乙胺水（65∶35），流速1 mL/min，漂移管温度85℃，氮气压力0.4 mPa，增益50，载气流速2.2 L/min，柱温40℃。

2.2 对照品溶液的制备

精密称定贝母素甲、乙对照品各2、1.5 mg，加甲醇溶解，制成每1 mL含贝母素甲0.2 mg、贝母素乙0.15 mg的混合溶液。

2.3供试品溶液的制备

精密称定粉末2 g，置50 mL具塞三角瓶中，加浓氨试液4 mL浸润15 min，精密加入三氯甲烷-甲醇4∶1的混合溶液40 mL，称定重量，混匀，超声（300 W，40 kHz）提取1 h，放冷，再称定重量，加上述混合溶液补足减失的重量，滤过。精密量取续滤液5 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5 mL定量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜过滤备用。

2.4线性关系的考察

取配好的标准品溶液，依次进样1、2、5、10、15、20 μL。以lgA为纵坐标，lgC为横坐标采用双对数线性回归处理方法得到贝母素甲的线性回归方程Y = 1.4260X+3.6371（r = 0.9998），线性范围为0.2～4.0 μg;贝母素乙的线性回归方程Y = 1.49X+ 3.50（r = 0.9996），线性范围为0.15～3.0 μg。

2.5 精密度试验

取对照品溶液，重复进样5次，每次10 μL，贝母素甲、乙峰面积积分值的RSD分别为1.08%、1.19%。

2.6 重复性试验

精密称取同一批浙贝母样品5份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样10 μL。贝母甲、乙峰面积积分值的RSD分别为2.06%、1.58%。

2.7 稳定性试验

精密称取同一份样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在1、3、5、7、9、12 h进样10 μL。贝母素甲、乙峰面积积分值的RSD分别为2.33%、2.55%。

2.8 加样回收率试验

精密称定已知含量的样品3 g共6份，加入内含贝母素甲2 mg/mL、贝母素乙1.5 mg/mL的对照品溶液，使加入对照品的量与样品中贝母素甲、乙的含量相当，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样10 μL。贝母素甲、乙的平均回收率分别为96.99%、96.81%，RSD分别为2.23%、2.37%。见表2。

2.9 含量测定结果

除了磐安县大处村（PA-DC）外，余下产地的贝母素甲、乙的总量均达到药典要求，栽培浙贝母的质量控制环节较为成熟。见表3。

2.10 贝母素甲、乙及总量的产地差异分析

不同产区贝母素甲、乙及二者总量存在明显差异。丽水市云和县龙埠村（LS-YH- LB）贝母素甲、乙的总含量最高，其次为温州市乐清盛家塘村（WZ-LQ-SJT）村，再次为丽水市缙云县外麻车村（LS-JY-WMC），磐安县大处村（PA-DC）贝母素甲、乙的总量最低，其次为宁波樟水（NB-ZS）产地。见图1。

2.11 贝母素甲、乙的含量比例差异分析

不同产区二者占总含量的比例并不是均匀分布的，14个产区的貝母素甲含量高于贝母素乙（LS-YH-LB、PA-DK、PA-DC、JS-NT、NS-ZS等），5个产区贝母素乙含量高于贝母素甲（LS-JY-QM、LS-JY-QC、NB-ZX等），还有8个产区二者含量相差不大（PA-ZT、PA-PT、WZ-YQ-SJT、NB-HX等）。贝母素甲含量最高为宁波章水镇（NB-ZS），其次为磐安县大处村（PA-DC），贝母素乙含量最高为缙云县潜陈村（LS-JY-QC），其次为缙云县古溪村（LS-JY-GX）和宁波樟溪村（NB-ZX）。见图2。

2.12 贝母素甲、乙及总量的聚类分析

运用SPSS 20.0软件进行聚类分析。27个产地共聚为两大类，第一大类为高含量组，包括LS-YH-LB、WZ-YQ-SJT、LS-JY-WMC、PA-ZT、LS-QY-YX、PA-DK、YK-BY、JS-NT 8个产区，贝母素甲乙的总含量大于0.15%，余下的19个产区聚为第二大类。聚类图中所有产地分散于不同的聚类分支中，并没有同一或相近产区聚为一类的现象，不同产区浙贝母中贝母素甲、乙及二者总含量没有根据产区呈现出明显的规律性。见图3。

3 讨论

3.1 浙贝母中功效成分地理变异形成原因的探讨

不同产区浙贝母中化学成分的含量差异较大，总含量最大值与最小值之间相差可达3.3倍，贝母素甲占总量的比例最大值与最小值之间相差可达1.5倍，贝母素乙占总量的比例最大值与最小值之间相差可达1.7倍。提示浙贝母存在显著的功效成分地理变异现象。导致植物地理变异的原因可分为环境、遗传、人为三大因素，其中环境和人为因素导致直接性的成分变化、遗传导致成分变化可被“烙印”而世代相传[10-12]。本研究中，浙贝母中有效成分并没有根据地理区域的位置而形成相应的聚类，所有产区散在分布在不同的聚类分支中，提示产区外在环境没有对浙贝母中化学成分的变化造成显著影响。由于浙贝母现基本为栽培[13]，种源混杂，还需要结合种源基因进一步研究方能彻底解析浙贝母功效成分地理变异形成的原因[14]。

3.2非道地产区浙贝母质量的分析

浙贝母主要分布于江苏南部、浙江北部和湖南等地，浙江省宁波市象山为浙贝母的道地产区[15]。近年来，金华市磐安县开始大规模引种栽培浙贝母，建立浙贝母规范化生产基地[16]，其产出已经有超越宁波产浙贝母之势。根据本研究结果，宁波产浙贝母和磐安县浙贝母中有效成分的含量并没有达到最高，反而丽水市云和县产浙贝母质量最优，聚类分析表明，浙贝母中有效成分不以产区为聚类倾向，说明在其他产区进行浙贝母栽培具有可行性。

3.3 浙贝母功效成分地理变异研究中存在的问题

本研究发现浙贝母功效成分存在显著的地理变异现象，这种地理变异没有呈现明显的地理区域规律，但在本研究所采集的样品中，明确了浙贝母质量最优产区，初步阐明了可能导致这种现象的原因。遗憾的是本研究所采集产区及样品数量有限，若想彻底解析浙贝母功效成分地理变异格局及规律，仍需扩大采样地点，加大样本量，浙贝母功能基因研究或许是揭开其地理变异遗传机制的一个新途径，目前已有学者针对其生物碱含量与功能基因表达的关系进行了研究[17-18]。另一方面，本研究对于采集地的土壤因子、气候因子、种植技术等信息还未能全面掌握，环境和种源依然是其功效成分地理变异的主要外在因素[19-20]。对浙贝母功效成分地理变异进行分析及探讨，仍需以此为基础开展进一步研究。

[参考文献]

[1] 何琛晔，张春椿，李石清，等.浙贝母品质现状及中药材生态适宜性的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2018， 24（2）：220-225.

[2] 林娜，张晓芹，蓝艳，等.浙贝母质量控制的研究进展[J].中国药房，2017，28（9）：1289-1292.

[3] 杜伟锋，岳显可，朱涛，等.不同产地加工方法浙贝母的高效液相色谱-电喷雾-质谱指纹图谱分析[J].中华中医药杂志，2016，31（12）：4956-4960.

[4] 沈秋，周洁，王卓琼，等.不同产地和品种对浙贝母主成分与生理生化特性的影響[J].中药材，2011，34（10）：1503-1508.

[5] 单云岗，俞忠明，傅跃青.浙贝母迁移至丽水庆元后的品质比较研究及其指纹图谱研究[J].中华中医药学刊，2017， 35（5）：1257-1260.

[6] 姜艳，李萍. HPLC-ELSD测定浙贝母中贝母素甲、贝母素乙的含量[J].中国药学杂志，2005，40（16）：1257- 1259.

[7] 雨田，练心洁，孙佑玲，等.浙贝母原产地及其迁地引种后含量分析[J].成都大学学报：自然科学版，2018，37（4）：370-372.

[8] 王路伟，沈晨薇，张水利，等.不同炮制方法对浙贝母药材3种生物碱含量的影响[J].中国现代应用药学，2018， 35（1）：80-84.

[9] 朱广磊，睢宁，张春椿，等.不同产地浙贝母药材HPLC-ELSD指纹图谱的研究[J].浙江中医药大学学报，2017， 41（5）：352-361.

[10] 董鹏斌，王宁，房敏峰，等.珍稀濒危植物卵叶羌活自然群体遗传变异的地理分布研究[J].中草药，2019，50（10）：2461-2466.

[11] 柴玲香，申琳，郭水良.单子叶植物核DNA含量地理纬度变异式样及其与气候因素关系[J].上海师范大学学报：自然科学版，2018，47（4）：428-435.