miR-373表达对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响
2020-04-02郭浩辛建海杨鑫磊徐鸿洁
郭浩, 辛建海， 杨鑫磊， 徐鸿洁△
北华大学附属医院 1肿瘤科， 2骨外一科(吉林吉林 132011)
卵巢癌是女性生殖器官肿瘤中病死率最高的恶性肿瘤，每年导致约14万妇女死亡[1-2]。近些年，随着诊疗技术的发展，肿瘤的预后有了很大改观，然而，由于卵巢癌被诊断时多数已经是晚期，卵巢癌的无瘤生存率仍然很低[3-4]。microRNA(miRNA)是一类非编码的短链RNA，由21～25个核苷酸组成，它可以通过直接结合到目的基因的3′UTR区域，导致目的基因mRNA的裂解或降解，对基因进行转录后的调控[5-6]。大量的研究表明，miRNA在各个生物中结构上具有高度的保守性，且存在于几乎所有生物体内，并且可以调节细胞的增殖、凋亡、衰老等几乎所有活动[7]。研究表明卵巢癌的发生伴随多种miRNA的异常，而且miRNA可以通过调控不同靶基因的表达量发挥抑癌或促癌的作用[8-9]。同时，由于miRNA在卵巢癌中的表达与正常卵巢不同，例如，miR-212、miR-31在卵巢癌中呈现低表达，miRNA也可以作为卵巢癌的标记分子[10-12]。miR-373，第一个被鉴定为具有人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell，ESC)特异性的miRNA，其作用因肿瘤种类的不同而不同[10-12]。在卵巢癌中，人们关于miR-373的研究多集中在迁移和侵袭方面。Zhang等[13]的研究发现miR-373可以通过调节癌基因Rab22a抑制卵巢癌的侵袭和迁移。Meng等[14]的研究发现外泌体miR-373可以用于表皮样卵巢癌的诊断和预测。然而，miR-373对卵巢癌增殖和凋亡的影响仍不明确。2018年6月至2019年10月，本研究将探究miR-373在卵巢癌增殖和凋亡方面的影响，为miR-373在卵巢癌中发挥的作用提供线索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂及仪器 胎牛血清(杭州四季青公司)， 细胞培养基RPMI 1640 (美国Sigma公司)，RNA提取试剂Trizol、RNA 反转录试剂盒及Real time PCR试剂盒(大连TaKaRa公司)， miR-373 mimics(中国吉玛公司)，Lip2000(中国sage creation公司)，CCK8试剂盒(日本Dojindo公司)，其他常用试剂为本实验室所有。
1.1.2 细胞培养 人卵巢表皮细胞系IOSE80、人卵巢癌细胞HO8910和SKOV-3购自中国上海细胞库，用含有10% 胎牛血清(BSA)100/mL的青霉素和链霉素的RPMI 1640 培养基培养，细胞消化用0.25% 胰蛋白酶，培养条件为37 ℃、5% CO2的培养箱；细胞生长状态观察使用倒置显微镜。
1.2 实验方法
1.2.1 Real-time PCR 检测miR-373的mRNA含量 用Trizol 裂解人卵巢表皮细胞系IOSE80、人卵巢癌细胞HO8910和SKOV-3细胞，并按照说明书提取细胞中的总RNA，取1 μg RNA，配制成10 μL反转录体系制备cDNA。然后，加反转录产物加入90 μL RNA酶-free的ddH2O。而后，取1.5 μL反转产物作为Real-time PCR的模板进行检测。以TaKaRa公司的U6 为内参照。miR-373引物序列： 5′-CCTTTCGCGGGGGTAAAACTCA-3′(上游)，下游引物为TakaRa试剂盒的通用引物。反应体系：SYBR Green PCR Master Mix 为5 μL,上下游引物(10 μ mol/L)各0.5 μL，cDNA模板为2 μL，加ddH2O 2.5 μL至10 μL反应体积。反应条件：第一步，95℃ 3 min; 第二步，95℃ 10 s，56℃ 15 s，72℃ 15 s，共35个循环；第三步，65℃ 5 s, 95℃ 5 s。
1.2.2 miR-373 mimics的转染 用Lip2000对处于对数期生长的细胞进行miR-373 mimics的转染。将100 pmol miR-373 mimics 或者阴性对照pre-miRNA溶于500 μL 无血清RPIM 1640培养液中，并用移液器混匀；将15 μL Lip2000溶于500 μL 无血清RPIM 1640培养液中，并用移液器混匀混匀。将两种液体混匀，室温放置20 min，中间不定期混匀培养液。将混合液体换至6 孔板中。6 h后将培养液换成含10%血清的RPIM 1640。
1.2.3 CCK8法检测细胞增殖 将转染miR-373 mimics或NC的IOSE80、HO8910和SKOV-3细胞用胰蛋白酶消化后，计数，并以8 000个细胞每孔的密度接种于96孔板中，每组同时设置6个复孔。每24 h取出一块96孔板，进行CCK8实验。 每孔中加入10 μL的CCK8溶液，置于37℃细胞培养箱孵育2 h，终止培养。酶标仪检测490 nm处的吸光度值。重复3次，绘制增殖曲线。
1.2.4 PI和Annexin V双染法检测细胞凋亡 转染miR-373 mimics 48 h后，用胰蛋白酶消化处理对数期生长的细胞，使其完全分散变为单个细胞，离心收集细胞。并用预冷的PBS洗涤3次，离心收集细胞，用PI和Annexin V双染法检测细胞的凋亡率。
1.2.5 Western blot 检测RAD54B的含量 用预冷的 PBS将对数期生长的细胞洗涤3 次，加入含蛋白酶抑制剂的RAPI 蛋白裂解液，冰上裂解15 min，12 000 r/min 离心 15 min，取上清液即为细胞总蛋白。用BCA法检测细胞蛋白浓度。蛋白变性：65℃，10 min。12% SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，恒压转移至 PVDF 膜后，以5% 脱脂奶粉室温封闭1 h; 加入相应的抗体，4 ℃冰箱孵育过夜，TBST 洗涤后加对应种属HRP 标记的 Ⅱ 抗室温孵育 1 h，ECL底物显色。
2 结果
2.1 miR-373在卵巢癌中呈现低表达 RT-PCR结果表明与人卵巢表皮细胞IOSE80相比，卵巢癌细胞HO8910和SKOV-3中，miR-373含量明显降低，且差异有统计学意义(P<0.01)。见图1、表1。
注：与IOSE80比较*P<0.01
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细胞nmiR-373t值∗P值∗IOSE8031.00±0.10HO891030.37±0.075.12<0.01SKOV-330.43±0.055.24<0.01
注：*与IOSE80比较
2.2 miR-373过表达的检测 RT-PCR结果显示：转染miR-373 mimics后，与NC组相比，miR-373 mimics转染组HO8910和SKOV-3细胞中的miR-373含量明显增高(P<0.05，P<0.01)。表明miR-373转染成功，可进行下一步的功能实验探究。见图2、表2。
注：与NC比较*P<0.05，**P<0.01
图2RT-PCR检测miR-373在HO8910和SKOV-E细胞中的表达量(n=3)
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细胞nmiR-373t值P值HO89107.025<0.05 NC31.00±0.32 miR-373 mimics329.64±3.85SKOV-37.860<0.01 NC31.00±0.43 miR-373 mimics344.46±5.50
2.3 miR-373促进卵巢癌细胞增殖 CCK8法检测miR-373过表达对卵巢癌细胞增殖的影响。miR-373过表达可明显促进卵巢癌细胞HO8910和SKOV-3的增殖(P<0.01)。见图3。
注:*P<0.01
2.4 miR-373抑制卵巢癌细胞凋亡 miR-373转染后，HO8910的凋亡率由(14.97±0.62)%明显降至(5.20±0.37)%(P<0.001)；SKOV-3的凋亡率从(12.30±0.46)%降至(8.73±0.89)%(P<0.05)；说明miR-373可明显抑制HO8910和SKOV-3的凋亡，且差异有统计学意义。见图4、表3。
2.5 生物信息学预测RAD54B是miR-373的靶基因 进一步利用生物学信息软件TargetMiner, TargetScanVert, TargetMiner对 miR-373的靶基因进行预测，结果锁定RAD54B。miR-373可结合于RAD54B的3′UTR第628～635位。见图5。
2.6 miR-373过表达使RAD54B的表达量降低 Western blot检测miR-373 mimics处理细胞后，RAD54B表达量的变化，miR-373的过表达可显著降低RAD54B的表达量。但是具体的miR-373是否可以直接调控RAD54B的表达，仍需双荧光素酶报告实验进一步验证。见图6。
注：与NC比较 *P<0.05, **P<0.001
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细胞n凋亡率(%)t值∗P值∗HO8910 NC314.97±0.62 miR-373 mimics35.20±0.3713.49<0.001SKOV-3 NC312.30±0.46 miR-373 mimics38.73±0.893.54<0.05
注：*与NC比较
3 讨论
卵巢癌仍是预后最为不良的妇科肿瘤，主要原因在于不能及时在卵巢癌早期进行发现和诊治，约70%的卵巢癌患者发现时已经是卵巢癌晚期[15-16]。已有的大量文献表明miRNA不仅可以作为卵巢癌的特异标记分子，还具有调控卵巢癌的增殖、凋亡、迁移、耐药等功能[17-19]。探究具体miRNA在卵巢癌中的功能及机制对人们对卵巢癌的认识至关重要。
图5 生物信息学预测miR-373与RAD54B的结合位点
图6miR-373mimics对HO8910和SKOV-3细胞中RAD54B表达量的影响
本研究中，我们首先检测了miR-373在卵巢癌细胞HO8910和SKOV-3中的含量，发现与人卵巢表皮细胞IOSE80相比，miR-373在HO8910和SKOV-3中的含量明显降低。提示，miR-373可能在卵巢癌中发挥作用。
我们过表达miR-373后，检测其在卵巢癌中的功能。结果发现，miR-373可以明显促进卵巢癌细胞HO8910和SKOV-3的增殖，进一步，凋亡检测结果发现，miR-373可以明显抑制卵巢癌细胞的凋亡。miRNA是作用于目的蛋白mRNA的3′UTR结合，导致目的基因mRNA的裂解或降解，从而对基因进行转录后的调控，抑制其表达。因此，我们对具体的分子机制进行探究，生物学软件预测RAD54B是miR-373的靶蛋白之一，并且，miR-373过表达可以明显降低RAD54B的表达量，说明其可能是通过调控同源重组修复相关蛋白RAD54B发挥作用。
RAD54B是RAD54的同源异构体，两者均在DNA双链断链引起的同源重组中发挥重要作用，但两者发挥的作用又各有不同。当DNA双链发生断裂时，RAD54将与RAD51结合，促使其正确结合于DNA双链断裂处[20]。此时，RAD54是与核酸内切酶Mus81/Eme1结合，而RAD54B则与减数分裂蛋白DMC1结合[21-22]。最近的研究表明，RAD54B在肿瘤中也存在异常，RAD54B的高表达可能是结直肠癌的复发的预测因子[22-24]。并且，RAD54B可以促进细胞的增殖，且抑制细胞凋亡[25]。
本研究中，我们猜测miR-373在卵巢癌中表达量减低，对RAD54B表达的抑制作用减弱，因此导致RAD54B表达量升高，卵巢癌细胞对DNA双链断裂的同源重组修复能力增强，进而避免细胞进入凋亡程序，促进卵巢癌的增殖增强。但是，本研究的猜测只是依赖于生物学信息中表明RAD54B是miR-373的靶基因，同时发现miR-373可以降低RAD54B的表达量，但具体机制仍需进一步探究。
