温胆汤干预同型半胱氨酸致内皮细胞损伤的机制研究

高血压是心脑血管疾病发生的重要病变基础，主要包括原发性高血压与继发性高血压。中国原发性高血压病人约1.6亿人[1]，在高血压人群中心脑血管疾病发病率高达95%以上，是导致死亡的主要单一因素。据WHO调查结果表明，全球每年因原发性高血压及其并发症而致死的病人约1 700万人[2]，严重威胁人类生命健康。H型高血压属原发性高血压伴有高同型半胱氨酸(Hcy)血症，是导致脑卒中的关键因素[3]，在我国成年高血压病人中其发病率约占75%[4]。大量研究表明，高血压与高Hcy血症对人体靶器官具有协同危害能力[5]，其中高Hcy可严重破坏血管内皮细胞，加剧血管异构，诱发心血管功能紊乱，最终导致心血管事件发生[6-8]。在西医治疗方面主要采用抑制Hcy生成或促进其代谢，但该方式对部分病人作用欠佳，相关的心血管事件亦未得到有效控制[9]。而中医学采用“整体观念、辨证论治”原则，可有效对机体进行全面调理。温胆汤最早载于唐·孙思邈《千金方》，具有理气化痰、清胆和胃等功效[10]，是H 型高血压临床治疗中常用的处方汤药[11]。因此，本实验拟建立体外Hcy致人脐静脉内皮细胞(HVVEC)损伤模型，并给予温胆汤含药血清进行干预，探讨温胆汤改善内皮功能的作用及机制，为温胆汤治疗H型高血压提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物与细胞株 SPF级雄性健康SD大鼠(200±20)g，由上海斯莱克实验动物有限公司(SCXK沪：2016-0002)提供；HUVEC细胞(ECV-304)，由中国科学院上海细胞库提供。

1.1.2 药品与试剂 温胆汤组方：半夏6 g，茯苓4.5 g，竹茹6 g，枳实6 g，陈皮9 g，炙甘草3 g。按相应流程进行煎煮[12]，合并水煎液进行蒸发浓缩，最终调至生药浓度为低剂量(1g/mL)和高剂量(2g/mL)，于4 ℃保存。维生素E(批号101228)，购自浙江医药股份有限新昌制药厂；Hcy(批号C-7352)。购自美国Sigma公司；胎牛血清，购自美国Gemini公司；胰蛋白酶、MTT、二甲亚砜，购自美国Sigma Aldrich公司； BCA蛋白定量试剂盒，购自南京碧云天生物技术研究所；ECL化学发光液，购自美国GE公司；p-P38MAPK、P38MAPK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-NF-κB、核转录因子-κB(NF-κB)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及p-eNOS抗体，购自美国CST公司；β-Tubulin、二抗，购自南京巴傲得生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；超敏C反应蛋白(hs-CRP)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6) ELISA检测试剂盒，购自上海西塘生物科技有限公司；其他试剂均由北京索莱宝科技有限公司提供。

1.1.3 主要仪器 SW-CJ-2FD超净工作台，苏州净化设备厂；CH20-BIM倒置显微镜，日本 Olympus公司；Synergy HT酶标仪，美国BioTeK公司；蛋白电泳、半干转膜系统，美国Bio-rad公司；Direct-Q超纯水仪，美国MILLIPORE公司；5417R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；IKA T18 basic匀浆器，德国ULTRATURRAX公司；二氧化碳(CO2)细胞恒温培养箱，日本SANYO公司；全自动图像分析系统，美国GE公司。

1.2 含药血清制备 取40只SPF级雄性健康大鼠，自由摄食、饮水，24 h昼夜循环，适应性喂养2～3 d。按体质量随机分为空白对照组、模型组、温胆汤低剂量组(20 g/kg)、温胆汤高剂量组(40 g/kg)及维生素E组(250 mg/kg)，每组8只，各给药组灌胃相应药物，空白对照组、模型组给予等量蒸馏水，连续7 d，腹主动脉采血，经离心、灭活、过滤得含药血清，并于-80 ℃保存。

1.3 细胞培养 将HUVEC从液氮取出，经复苏后用DMEM培养基(10%FBS+1%P/S)进行重悬，随后置于37 ℃、5% CO2的恒温恒湿孵育箱中培养。隔天换液1次，待细胞融合至80%～90%时进行传代操作。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 细胞增殖率检测 取对数生长期HUVEC细胞，加入DMEM重悬稀释至5×104个/mL接种于96孔培养板，每孔100 μL，培养24 h待细胞贴壁后更换无血清培养基80 μL继续培养24 h，给药组每孔加入温胆汤含药血清(20 g/kg、40 g/kg)、维生素E含药血清(250 mg/kg)各10 μL进行预处理1 h，除空白对照组外各组每孔加10 μL的Hcy(200 μmol/L)进行刺激损伤。在各平行操作条件下，未处理组给予等量的空白血清。23 h后每孔加MTT溶液20 μL，4 h后更换DMSO溶液150 μL，震荡10 min后置于酶标仪(波长490 nm处)进行吸光度检测。

1.4.2 细胞因子分泌水平检测 取对数生长期HUVEC细胞，加入DMEM重悬稀释至1×105个/mL接种于6孔培养板，每孔2 mL，培养24 h待细胞贴壁后更换无血清培养基1.6 mL继续培养24 h，给药组每孔加入温胆汤含药血清(20 g/kg、40 g/kg)、维生素E含药血清(250 mg/kg)各200 μL进行预处理1 h，除空白对照组外各组每孔加200 μL的Hcy(200 μmol/L)进行刺激损伤。在各平行操作条件下，未处理组给予等量的空白血清。23 h后收集细胞上清液，分别采用比色法检测SOD、MDA、ROS、NO含量，ELISA法检测hs-CRP、TNF-α、IL-6水平。

1.4.3 P38MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达水平检测 取对数生长期HUVEC细胞接种于6孔板内，分组与给药方式同上。处理后收集细胞裂解液，进行BCA蛋白定量，SDS-PAGE凝胶电泳、转膜。浸于5% BSA封闭，分别用p-P38MAPK、P38MAPK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-NF-κB、NF-κB、eNOS以及p-eNOS一抗过夜孵育(1∶2 000，4 ℃)。次日漂洗后加入二抗孵育30 min(1∶5 000，常温)，再漂洗后ECL化学发光、显影。ImageQuant软件扫描并分析相应灰度值，检测需重复3次。

2 结 果

2.1 温胆汤对HUVEC增殖率的影响 经检测，与空白对照组比较，模型组中HUVEC增殖率显著下降(P<0.01)。在温胆汤的干预作用下，HUVEC增殖活力增加，温胆汤高剂量组、维生素E组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。提示温胆汤可有效改善Hcy引起的细胞增殖抑制作用。详见图1。

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 温胆汤对HUVEC中MDA、SOD、ROS及NO分泌的影响 温胆汤可减少HUVEC中MDA和ROS分泌，增加SOD、NO含量。与空白对照组比较，模型组HUVEC中MDA和ROS表达水平增高(P<0.01)；给予不同浓度温胆汤治疗后，MDA及ROS水平下降。与模型组比较，温胆汤(20 g/kg、40 g/kg)与维生素E可明显减少MDA、ROS表达(P<0.05或P<0.01)。与空白对照组比较，模型组HUVEC中SOD和NO表达水平下降(P<0.01)；给予不同浓度温胆汤治疗后，SOD及NO水平提升；与模型组比较，温胆汤(20 g/kg、40 g/kg )与维生素E可明显增加SOD、NO表达(P< 0.01)。提示温胆汤具有缓解氧化应激，增强内皮功能的作用。详见表1。

表1 温胆汤对HUVEC中MDA、SOD、ROS及NO分泌的影响(±s)

模型组与空白对照组比较，①P< 0.01；与模型组比较，②P< 0.05，③P< 0.01。

2.3 温胆汤对HUVEC中IL-6、hs-CRP及TNF-α分泌的影响 与空白对照组比较，HUVEC在Hcy刺激下其炎症因子表达量显著增加(P<0.01)，给予不同浓度温胆汤干预后，IL-6、hs-CRP及TNF-α水平均下降。在IL-6方面，与模型组比较，温胆汤(20g/kg、40g/kg )与维生素E均可明显降低IL-6表达(P<0.05或P< 0.01)；在hs-CRP方面，与模型组比较，温胆汤(20 g/kg、40 g/kg )与维生素E可明显降低hs-CRP表达(P<0.05或P< 0.01)；在TNF-α方面，与模型组比较，温胆汤(20 g/kg、40 g/kg )与维生素E可明显降低TNF-α表达(P<0.05)；在降低IL-6、hs-CRP及TNF-α分泌中以温胆汤(40 g/kg)与维生素E作用更强。由此提示，温胆汤可改善Hcy刺激引起的炎症反应。详见表2。

表2 温胆汤对HUVEC中IL-6、hs-CRP及TNF-α分泌的影响(±s)

模型组与空白对照组比较，①P< 0.01；与模型组比较，②P< 0.05，③P< 0.01。

2.4 温胆汤对HUVEC中P38MAPK、ERK1/2、NF-κB和eNOS活化的影响 温胆汤可抑制HUVEC中P38MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白的活化，与空白对照组比较，模型组HUVEC中P38MAPK、ERK1/2、NF-κB活化量显著增加(P<0.01)，各浓度温胆汤与维生素E可减少其活化量。温胆汤(20 g/kg、40 g/kg )与维生素E均可有效降低p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-NF-κB表达量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与空白对照组比较，模型组HUVEC中p-eNOS活化量显著降低(P<0.01)，各浓度温胆汤与维生素E可增加其活化量。温胆汤(20 g/kg、40 g/kg )与维生素E均可有效促进eNOS活化，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见图2。

注：与空白对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图2 温胆汤对HUVEC中P38MAPK、ERK1/2、NF-κB和eNOS活化的影响

3 讨 论

血管内皮细胞具有调节血管生长，维持凝血纤溶平衡以及参与免疫炎症等功能，是维持正常心血管功能的重要物质基础。研究发现，同型半胱氨酸属蛋氨酸代谢中产物，可作为动脉粥样硬化的独立危险因素[13]，而内皮细胞是其重要损伤器官[14-15]，因此，Hcy损伤内皮细胞诱发的内皮功能障碍可推进动脉粥样硬化及其相关心血管事件的发生、发展[16]。氧化应激反应在内皮功能损伤、障碍进程中发挥着关键作用。已有研究表明，Hcy在代谢进程中可通过巯基的自身氧化累积大量的氧化自由基，导致内皮细胞中的氧化应激反应[17]。SOD作为机体清除自由基、防止细胞受损的主要酶，其活力的高低体现了抗氧化的能力[18]；MDA作为细胞壁破裂及其膜脂降解的终产物，体现了细胞经氧化反应后的受损程度[19]；ROS作为重要的氧化还原产物，可直接损伤内皮细胞或介导信号传导进而加重损伤[20]。因此，同时检测SOD、MDA及ROS可有效反映体内氧化应激水平。本实验结果发现，温胆汤可有效抑制Hcy诱发的MDA、ROS分泌，促进SOD合成，缓解内皮细胞中氧化应激反应，具有一定的内皮保护作用。

有研究表明，炎症信号传导受多种复杂网络通路调控。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内信号传导中的重要途径，在机体的正常生理与病理中起到关键调控作用[21]，P38丝裂原活化蛋白激酶在细胞生长、增殖、分化及凋亡中占据重要地位，是各类信号传导的交集之处，而该信号途径的激活又受氧化应激的影响[22]。P38MAPK激活后可诱导ERK1/2的活化继而促进NF-κB转录，间接调节炎症因子表达，参与炎症反应与血管重构[23]。多项研究表示，P38MAPK信号通路激活后可诱导内皮细胞分泌炎症因子IL-6、TNF-α和hs-CRP[24-25]，而上述炎症因子又可协同加重内皮细胞损伤，加剧血管粥样硬化、增加血流阻力，继而共同影响高血压的形成、发展、预后转归[26]。本研究发现，温胆汤可有效减少IL-6、TNF-α、hs-CRP分泌，抑制P38MAPK、ERK1/2及NF-κB活化。由此表明，温胆汤可通过调控P38MAPK/NF-κB信号通路，缓解由氧化应激而导致的内皮细胞炎症反应。另有研究表明，NO作为内皮细胞分泌的具有松弛血管平滑肌、调节张力、抗动脉粥样硬化等作用的关键因子，受其关键酶eNOS调节分泌，而eNOS合成亦受P38MAPK信号介导[27]，可通过抑制P38MAPK信号通路促进eNOS磷酸化，继而发挥血管内皮保护，改善动脉粥样硬化及抗高血压等作用[27]。本实验结果表明，温胆汤干预后，HUVEC中eNOS及NO水平得到明显提升，提示温胆汤可通过抑制P38MAPK/NF-κB信号传导，恢复损伤后的内皮细胞功能。

综上所述，温胆汤可通过下调内皮细胞中Hcy诱导的氧化应激水平，减轻由其加剧的P38MAPK/NF-κB信号传导，继而缓解内皮细胞炎症损伤、恢复内皮功能，最终达到抗动脉粥样硬化、抗血栓、降血压等作用，在临床H型高血压治疗中发挥重要的应用价值。