粘质沙雷氏菌对榛实象甲中肠细菌多样性的影响

张 平,马晓乾,马 玲

(1.东北林业大学黑龙江省林木保护技术创新中心；2.黑龙江省林业科学院森林保护研究所，黑龙江 哈尔滨 150040)

榛实象甲(CurculiodieckmanniFaust)属鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)，是榛子主产区危害果实的重要害虫.成虫刺吸榛树嫩叶、芽和幼果胚等部位汁液，取食会造成树枝局部损伤，损伤部位易遭受风折;交配后将卵产于果内，卵孵化后，幼虫在果内取食核仁，危害隐蔽，防治难度大.一直以来对榛实象甲的防治主要以化学防治为主，但药剂的不合理使用，常常造成榛果发苦，失去食用价值[1].因此，寻求效果较好的生物防治方法对于榛子的生产具有重要意义.

粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)为革兰氏阴性菌，能够产生鲜红色素，在自然界广泛分布.粘质沙雷氏菌及其代谢产物能够防治多种农林害虫.张晶等[2]从红棕象甲(Rhynchophorusferrugineus)的卵和死亡幼虫体内分离到粘质沙雷氏菌亚种HN-1，使用该菌感染红棕象甲幼虫，死亡率达到60%，卵孵化率降低80%；杨建云等[3]从患病的黄曲条跳甲(Phyllotretastriolata)幼虫体内分离到一株对成虫具有较高致病性的菌株PS-1，经形态观察、Biolog系统及16S rDNA检测将其鉴定为粘质沙雷氏菌，经过饲喂处理，发现其对黄曲条跳甲具有较强的毒杀效果.

昆虫肠道细菌长期定殖在寄主昆虫肠道内，与昆虫形成稳定的共生关系.已报道的常见昆虫肠道共生菌有埃希氏菌属(Escherichiasp.)、乳杆菌属(Lactobacillussp.)、沙雷氏菌属(Serratiasp.)、泛生菌属(Pantoeasp.)、微杆菌属(Microbacteriumsp.)等[4].不同昆虫的肠道细菌群落结构不同，同种昆虫雌虫和雄虫群落结构也存在差异.在这些细菌群落中，比例最大的为非致病菌.非致病菌能够为昆虫提供生长发育所必需的营养物质，包括必需的氨基酸、B族维生素、氮源、甾醇和萜烯类化合物等[5-6]，还能通过解毒和代谢途径来抵御外界病原微生物的危害.例如：Pai et al[7]在德国小廉(Blattellagermanica)的肠道中分离到多种细菌，这些细菌可以抑制多种寄主病原真菌的生长；沙漠飞蝗(Schistocercagregaria)肠道细菌能通过分泌抗真菌物质(如酚类物质等)抑制多种昆虫和植物病原真菌的生长，有助于保护寄主和昆虫[8];白蚁(Isoptera)肠道共生链霉菌(Streptomyces)分泌的抗菌性次级代谢产物可以抑制多种真菌的生长[9].昆虫的整个生活史中，常常遭受病原微生物(如真菌、细菌、病毒、线虫等)的外部入侵，但有关外界致病菌对昆虫肠道内非致病菌影响的研究较少.

本实验室在先前的研究中，证实了分离的粘质沙雷氏菌对榛实象甲成虫具有杀虫活性，可导致其中肠细胞脱落、空洞等[10].然而，粘质沙雷氏菌对榛实象甲成虫肠道菌群的影响尚不明确.为此，本研究采用高通量测序技术，在实验室条件下测定粘质沙雷氏菌对榛实象甲中肠菌群的影响，旨在为榛实象甲害虫的防治提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试虫源 榛实象甲成虫来源于辽宁省铁岭市郜家店镇榛园(北纬42°42′52.50″、东经124°28′9.00″)，于晴朗天气下人工震落采集.将采集的成虫放入低温保温箱，运送至实验室.

1.1.2 供试菌株 粘质沙雷氏菌(命名为AZW1)分离自一只意外死亡的榛实象甲幼虫体腔内，菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.16684.

1.2 方法

1.2.1 榛实象甲室内喂养和试验设计 将成虫置于无菌培养瓶中，每瓶放置5头，瓶内放入3片新鲜榛树嫩叶(冰箱中4 ℃保存)，每7 d更换一次叶片(最长可成活60 d)，瓶内铺设无菌水浸湿的滤纸，并放入人工气候箱中(25 ℃，湿度45%，光照度2 lx，昼夜时间12 h/12 h)饲养.成虫饲喂叶片前饥饿7 d，以便排除肠道中残余的食物.对照组为健康的雌虫和雄虫，处理组为细菌AZW1感染后第5天死亡的昆虫(因对照组雌虫和雄虫肠道菌群多样性无显著差异，故处理组不区分雌、雄)，处理组取食的叶片预先使用浓度1.8×108CFU·mL-1的细菌发酵液喷雾.每组3个重复，每次10头.

1.2.2 榛实象甲中肠解剖 分别选取上述10头健康的雌虫和雄虫，以及菌株AZW1感染后死亡的雌、雄虫.整个解剖过程在超净工作台内进行，参照Lou et al[11]的方法并有所改进.先将整个成虫浸入3%次氯酸中1 min，然后用70%乙醇浸泡3 min，再用无菌水冲洗3遍，最后用无菌磷酸缓冲液(PBS,pH=6.8,0.2 mol·L-1)冲洗2次.用无菌剪刀将虫体腹部轻轻剪开，从尾部排泄孔将肠道缓慢拉出，用PBS冲洗3次，然后将肠道置于100 μL无菌水中，用镊子将肠道内容物轻轻刮出；收集10条肠道后，将肠道样品放入-80 ℃冰箱中保存.取30 μL第3次清洗肠道的PBS溶液涂抹在LB培养基上作为空白对照.将肠道外壁清洗干净，在液氮下充分研磨，称取200 mg粉末加入到2 mL离心管内，置于冰上备用.

1.2.3 榛实象甲肠道细菌DNA提取与PCR扩增 榛实象甲成虫肠道总DNA提取步骤参照QIAGEN公司试剂盒说明书.取4 μL肠道总DNA溶液与1 μL上样缓冲液，用移液器反复抽吸混匀，点入1%琼脂糖凝胶孔内，水平电泳仪中(100 V)电泳15 min，将琼脂糖凝胶转入凝胶成像系统中检验DNA完整性.取2 μL DNA溶液，使用微量分光光度计检测DNA 溶液浓度(D260 nm/D280 nm,D260 nm/D230 nm).以DNA为模板，细菌引物为806R (5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)、341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)，PCR扩增菌株16S rDNA V3-V4区.第1轮扩增反应体系(50 μL):10×Buffer KOD 5 μL，2 mmol·L-1dNTPs 5 μL，25 mmol·L-1MgSO43 μL，Primer F (10 μmol·L-1) 1.5 μL，Primer R (10 μmol·L-1) 1.5 μL，KOD酶1 μL，稀释后模板2 μL，ddH2O 31 μL.PCR反应程序:94 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，65 ℃退火30 s,35个循环；68 ℃延伸30 s，68 ℃再伸5 min，4 ℃保存.第1轮PCR反应之后参照AMPure XP Beads试剂盒方法进行产物纯化，上清液转移到干净的PCR管中.取2 μL纯化液用 Qubit 3.0检测，检测后进行第2轮扩增.PCR扩增体系(50 μL):10×Buffer KOD 5 μL，2 mmol·L-1dNTPs 5 μL,25 mmol·L-1MgSO43 μL,Index Primer (10 μmol·L-1) 1 μL，通用PCR引物(10 μmol·L-1)各1 μL，KOD酶1 μL，稀释后模板2.5 μL，ddH2O 30.5 μL.PCR反应程序：94 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，65 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s,68 ℃再伸5 min，15个循环.使用AMPure XP Beads对第2轮扩增产物进行纯化，一步法实时荧光定量PCR系统(Life Technologies)进行定量，根据Hiseq 2500的PE 250模式上机测序.

1.2.4 MiSeq对16S rDNA基因扩增子的测序 根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7)对每个样品进行拼接[12]，拼接后经过过滤处理得到高质量tags数据[13].参照Qiime(V1.9.1)的tags质量控制流程[14]，将tags序列通过UCHIME Algorithm[15]与数据库(Gold database)进行比对检测嵌合体序列，并去除其中的嵌合体序列[15]，得到最终的有效数据(effective tags).利用Uparse 软件(Uparse v7.0.1001)[16]对所有样品的effective tags进行聚类，对OTUs代表序列进行物种注释；用SILVA的SSUrRNA数据库[17]与Wang et al[18]的方法分析物种注释(设定阈值为0.8～1.0)；使用MUSCLE(Version 3.8.31)软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系.使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Chao、Shannon、Simpson和ACE指数，使用R软件(Version 2.15.3)绘制稀疏曲线及PCA、PCoA和NMDS图.用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Unifrac距离并构建UPGMA样品聚类树.

1.3 数据分析

通过对16S rDNA基因的拷贝数进行单向ANOVA(SPSS 23.0)来分析不同处理组榛实象甲中肠细菌丰度差异的显著性.在统计分析之前，将16S rDNA基因拷贝数进行对数转换.

2 结果与分析

2.1 榛实象甲成虫肠道细菌总DNA扩增结果

琼脂糖凝胶电泳结果(图1)显示，DNA扩增条带很亮，除主带之外无其余杂带，无拖尾，说明DNA扩增质量较好，没有降解现象，满足后续上机测序的要求.

2.2 16S rDNA V3-V4基因序列的基本统计

根据榛实象甲成虫中肠细菌测序下机数据，将序列进行拼接和质控，得到榛实象甲中肠细菌16S rDNA V3-V4区域的有效数据(表1).拼接后的健康雌虫和雄虫及感染虫体有效序列比例分别为94.38%、92.82%和64.89%，且感染后的榛实象甲成虫肠道细菌原始下机序列数量明显高于健康雌虫和雄虫(P<0.05).通过图2可以看出，榛实象甲中肠细菌3条稀疏曲线测序数量趋于缓和，说明本次测序能够反映榛实象甲成虫中肠细菌所包含的全部群落组成，并能间接反映肠道细菌种类的丰富程度.

表1 榛实象甲成虫中肠细菌样品序列统计1)Table 1 Statistics on the bacteria samples from the midguts of hazelnut weevils

1)Raw PE表示原始下机的PE reads；Raw tags是指拼接得到的tags序列；Clean tags是指过滤质量低和长度短后的tags序列：Effective tags是指过滤嵌合体后，最终用于后续分析的tags序列；AvgLen指Effective tags的平均长度；Q20和Q30分别指有效序列中碱基质量值>20(测序错误率<1%)和30(测序错误率<0.1%)的碱基.DBL1为健康雌虫;DBL2为健康雄虫;DBL3为感染后的榛实象甲(不分雌、雄).*表示与雌、雄虫对照组相比差异显著(P<0.05).

2.3 榛实象甲成虫中肠细菌群落多样性

通常群落丰富度用 Chao和ACE指数表示，Chao和ACE指数值越大，群落丰富度越高.群落多样性通常用Shannon和 Simpson指数表示，Shannon和Simpson指数值越大，群落多样性越高.从表2中可以看出，榛实象甲健康雌虫和雄虫中肠细菌群落多样性指数差异不显著(P>0.05)，而细菌AZW1感染后的榛实象甲成虫中肠细菌群落多样性指数明显低于健康雌虫和雄虫(P<0.05).由图3可以看出，γ-变形菌纲和β-变形菌纲为榛实象甲健康雌虫和雄虫中肠细菌的优势群落，分别占89.7%和89.9%；而AZW1感染后的榛实象甲成虫中肠细菌主要为γ-变形菌纲，占细菌总量的99.9%.

表2 榛实象甲成虫中肠细菌多样性指数1)Table 2 Diversity indexes of the midgut bacteria in hazelnut weevils

1)DBL1为健康雌虫;DBL2为健康雄虫;DBL3为感染后的榛实象甲(不分雌、雄).*表示与雌、雄虫对照组相比差异显著(P<0.05).

2.4 榛实象甲成虫中肠细菌群落组成

选取排名前35的榛实象甲成虫中肠细菌，按丰度信息聚类分析后绘制热图.由图4得出，榛实象甲健康雌虫和雄虫中肠细菌群落组成接近一致，而AZW1感染后死亡的榛实象甲中肠细菌群落丰度低于健康雌虫和雄虫.这表明粘质沙雷氏菌改变了榛实象甲中肠细菌群落的组成.

由图5可以得出,榛实象甲中肠细菌主要由10个门组成，分别为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospira).变形菌门在榛实象甲健康雌虫和雄虫中比例最大，放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和厚壁菌门次之，且雌虫和雄虫肠道群落结构基本一致；但菌株AZW1感染后死亡的榛实象甲中肠细菌群落结构发生了明显改变，主要为变形菌门，相对丰度达74.6%.

3 讨论与结论

本研究表明，榛实象甲健康雌虫和雄虫中肠细菌群落结构之间无统计学差异，主要由变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门10个门组成.已报道的其他昆虫如华山松大小蠹(Dendroctonusarmandi)雌、雄肠道细菌群落结构存在差异[19].由此推测榛实象甲成虫中肠细菌群落结构可能相对保守，简单的肠道细菌结构在雌、雄成虫中扮演相似的角色.变形菌门在榛实象甲健康雌、雄成虫中肠中为优势菌，这与学者对沙漠飞蝗和光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)的研究结果[20-21]一致；然而，在大栗鳃角金龟(Melolonthamelolontha)肠道中厚壁菌门为优势菌[22].造成这种差异的原因与环境温度、地理位置、海拔高度等因素有关[23-24].因此，后续将对不同发生地的榛实象甲成虫肠道细菌进行进一步研究.

当肠道微生物的群落结构被破坏时，寄主的抗病能力降低，从而易感病[25].本研究发现，经AZW1感染后的榛实象甲中肠细菌群落丰度发生了明显改变，变形菌门比例上升，相对丰度达74.6%，其他门类菌群丰度明显降低，仅占25.4%.由此说明菌株AZW1对榛实象甲成虫中肠细菌群落结构造成了一定影响.Broderick et al[26]研究表明，取食含有苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的饲料后，去除肠道细菌的舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫未出现死亡，而保留肠道细菌的舞毒蛾出现了死亡，得出由苏云金芽孢杆菌导致的死亡情况取决于该虫肠道的细菌.有关AZW1感染榛实象甲成虫死亡的原因需进一步研究.