基于RAD-seq简化基因组测序的金湖乌凤鸡遗传进化研究

韩 威,沈华伟,殷建玫,朱云芬,沈海玉,李国辉,薛 倩,张会永,苏一军,窦新红,王克华,邹剑敏

(1.江苏省家禽科学研究所，江苏 扬州 225125;2.福建省畜牧总站，福建 福州 350003)

金湖乌凤鸡原产于福建省泰宁县，2009年通过国家畜禽遗传资源委员会鉴定.金湖乌凤鸡饲养历史悠久，在长期的选择和进化过程中形成了乌皮、乌骨、乌肉、凤头、毛脚等典型特征，是我国家禽库中具有特殊经济价值的遗传资源.

开展鸡种资源遗传进化研究，可以为品种资源的保护及开发利用提供基础信息.目前，研究者已利用微卫星DNA标记及线粒体DNA序列变异分析了金湖乌凤鸡的遗传多样性和遗传结构[1]，多个与乌骨鸡黑色素沉积相关的功能基因(MC1R、EDN3等)也被鉴定[2-4].然而，这些DNA标记数量较少，其所代表的基因组遗传变异信息量非常有限，针对除黑色素沉积之外的金湖乌凤鸡其它种质特性评价及功能基因发掘研究仍较少.

新一代测序技术实现了DNA分子标记高通量检测[5]，为从基因组水平上揭示鸡遗传进化提供了高效准确的方法.其中，全基因组重测序费用较高，600 K鸡芯片仍基于商业化蛋鸡和肉鸡及非商业的远交群基因组重测序数据开发.简化基因组测序由于能鉴定出合适数量、广泛覆盖基因组范围的变异位点，已被用于不同物种群体的遗传进化研究[6-8].基于此，本研究利用简化基因组RAD-seq测序(restriction-site associated DNA sequencing,RAD-seq)鉴定金湖乌凤鸡基因组SNP标记，揭示金湖乌凤鸡的遗传多样性和遗传结构，鉴定受选择基因，为金湖乌凤鸡种质特性评价、品种资源保护及开发利用提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

金湖乌凤鸡及对照组18个地方鸡品种为狼山鸡、安义瓦灰鸡、固始鸡、仙居鸡、白耳黄鸡、东乡绿壳蛋鸡、河南斗鸡、文昌鸡、大围山微型鸡、藏鸡、茶花鸡、瓢鸡、惠阳胡须鸡、大骨鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、边鸡、北京油鸡、2个引入鸡品种隐性白羽肉鸡、安卡红鸡来自国家级地方鸡种基因库(江苏)保种群.每个品种按照家系选择30个个体(10公、20母)，个体间无亲缘关系.翅静脉采血1.0 mL～1.5 mL，柠檬酸钠抗凝，-20 ℃保存备用.

1.2 方法

1.2.1 RAD-seq 简化基因组测序 常规酚—氯仿法提取基因组DNA，构建pair-end文库(300～500 bp)进行EcoRI(G^AATTC)和NlaIII(Hin1IICATG^)双酶切RAD-seq简化基因组测序.

1.2.2 SNP质控 SNP的鉴定采用GATK和samtools程序.质控条件：Q20>95%，ddRAD depth>60%，在所有样品中的SNP Call rate>70%，在单个鸡种中的SNP Call rate>90%，MAF>0.05.

1.2.3 统计分析 观察杂合度(Ho)、近交系数(Fis)和群体分化指数(Fst)计算采用PopGen软件[9]，群体聚类分析应用MEGA软件UPGMA聚类法[10].连锁不平衡(LD)分析和选择信号检测采用PLINK软件[11]，采用θπ比率和Fst分化系数相结合方法，以100 kb为窗口、10 kb为step计算滑动的θπ和Fst值分布.统计分析基于常染色体(Chr1～33)SNP标记.

2 结果与分析

2.1 基因组SNP鉴定

经过两步数据质控，在金湖乌凤鸡中鉴定出SNP 325 531个.总体上，SNP数量与染色体长度呈正相关，大染色体SNP数量较多，其中1～9号及Z染色体SNP数量均超过9 000个，小染色体SNP数量较少(表1).

表1 SNP在不同染色体上的分布Table 1 SNP distributions on different chromosomes

2.2 群体遗传多样性

群体遗传多样性统计量结果表明，金湖乌凤鸡的观察杂合度Ho为0.213 6，核苷酸多样度Pi为0.240 4，近交系数Fis为0.111 6(表2).与其它地方鸡种相比，金湖乌凤鸡的遗传多样性较为丰富.

2.3 群体遗传结构

金湖乌凤鸡与河南斗鸡(0.214 3)、北京油鸡(0.184 5)和固始鸡(0.180 2)之间的遗传分化系数Fst最高，与瓢鸡(0.107 9)、文昌鸡(0.120 2)和惠阳胡须鸡(0.124 1)之间的遗传分化系数Fst最低，相对应的基因流Nm也最高，分别为2.067 7、1.830 2和1.764 7(表3).以隐性白羽肉鸡、安卡红鸡做外群构建的UPGMA聚类结果表明，金湖乌凤鸡形成了一个相对独立的分支(图1).

表2 种群的观察杂合度、核苷酸多样度和近交系数Table 2 Values of Ho,Pi and Fis for tested breeds

表3 金湖乌凤鸡与其它品种间遗传分化系数和基因流Table 3 Fst and Nm between Jinhu Wufeng chicken and other breeds

JH金湖乌凤鸡、LS狼山鸡、WH安义瓦灰鸡、GS固始鸡、XJ仙居鸡、BE白耳黄鸡、DX东乡绿壳蛋鸡、DJ河南斗鸡、WC文昌鸡、WX大围山微型鸡、ZZ藏鸡、CH茶花鸡、PJ瓢鸡、HX惠阳胡须鸡、DG大骨鸡、XS萧山鸡、LY鹿苑鸡、BJ边鸡、BY北京油鸡、RW隐性白羽肉鸡、AK安卡红鸡.图1 金湖乌凤鸡及其它鸡种的UPGMA聚类Fig.1 UPGMA phylogenetic tree of Jinhu Wufeng chicken and other breeds

2.4 选择信号

结合核苷酸多样度θπ比率和遗传分化系数Fst的选择信号分析发现23个染色体区域受到选择，104个受选择基因.功能分析结果表明，整体上，受选择基因主要富集在代谢过程、发育过程、细胞信号传导和刺激响应等生物学通路(图2).其中，与黑色素沉积(TFAP2C、GDNF、MC1R、EDN3、TBX1、GLI3、GNAQ、MEF2C)、辐射响应(ERCC8、PRKAA1)、就巢行为(PRLR、CYP24A1、VIPR-1)、皮肤发育(THBS4、THAP1、DHCR24)及抗病力(PDE4D、NFATC2、TNFAIP8)相关的基因显示出强烈选择信号.

图2 受选择区域基因功能注释Fig.2 Functional annotation and classification of the selected genes

3 讨论

3.1 金湖乌凤鸡遗传多样性和遗传结构

文中利用RAD-seq测定了19个地方鸡种的基因组序列，通过质控在金湖乌凤鸡中鉴定出325 531个SNP标记，这为构建品种分子标签和在基因组水平上开展遗传进化分析提供了基础.

在19个地方鸡种中，金湖乌凤鸡的观察杂合度Ho为0.213 6，核苷酸多样度Pi为0.240 4，遗传多样性较为丰富，这与已报道的基于微卫星DNA及线粒体DNA的金湖乌凤鸡遗传变异分析结果基本一致[1].金湖乌凤鸡与其它地方鸡种的平均遗传分化系数Fst为0.155 6，平均基因流Nm为1.398 2，在进化树上形成相对独立的分支.金湖乌凤鸡原产地交通闭塞形成自然隔离，很少有外来鸡种进入，与其它地方鸡品种间的基因交流相对较少；已报到的针对我国地方乌骨鸡品种遗传多样性研究，也发现金湖乌凤鸡除与相同产区的丝绒乌骨鸡间遗传距离较近外，与其它乌骨鸡品种间遗传距离均较远[12].

金湖乌凤鸡群体的近交系数Fis(0.111 6)相对较高，提示在保种过程中要严格控制近交水平的过快增加.

3.2 金湖乌凤鸡选择信号

自然选择和人工选择作用会在动物基因组上留下选择信号，开展选择信号分析有助于理解遗传变异对表型的塑造.研究者通过检测地方猪、羊等品种的基因组选择信号，发掘出大量种质特性基因[13-16].针对鸡而言，Rubin et al[17]通过重测序在家鸡中鉴定了与代谢调节和生殖光周期调控相关的促甲状腺激素受体基因TSHR，在肉鸡中检测到的几个选择性片段上，发现与生长、食欲和代谢调控相关的基因重叠在一起.Elferink et al[18]利用芯片检测了商业化品系鸡、荷兰和中国地方鸡种的基因组变异，发现396个染色体区域受到选择作用，其中26个区域显示出强烈的选择信号.Wang et al[19-20]研究表明，藏鸡群体中受到选择作用的基因在钙离子信号通路中显著富集，大量视觉相关基因在家鸡驯化过程中受到正选择作用，导致视觉退化.

研究中，选择信号分析结果表明，金湖乌凤鸡中有23个染色体区域受到选择作用，104个受选择基因显著富集于不同的生物学通路.黑色素沉积是乌骨鸡品种进化过程中形成的最显著特征.神经嵴细胞是一种多能细胞，分化的成黑素细胞沿背侧途径迁移，定位至皮肤、冠及组织，并形成成熟的黑色素细胞[2,21].选择信号分析发现金湖乌凤鸡基因组中，多个与神经嵴细胞分化迁移、黑色素细胞发育增殖及黑色素合成相关的基因受到了选择，包括TFAP2C、GDNF、MC1R、EDN3、TBX1、GLI3、GNAQ、MEF2C等.研究证实，TFAP2家族(包括TFAP2A、TFAP2B和TFAP2C)是神经嵴诱导所必需的[22,23]，GDNF[24,25]、TBX1[26,27]是神经嵴细胞发育和迁移的调节因子，MEF2C在神经嵴表达并调节黑色素细胞发育[28,29]，GNAQ基因变异与黑素瘤生成有关[30,31].MC1R属于G蛋白偶联受体家族成员，在黑色素细胞与黑色素合成激素的互作中起着重要的信号传递作用，是影响皮毛色素沉积的重要基因；杨永升等[32]研究发现MC1R基因突变与鸡肤色、肉色和胫色显著相关.EDN3在神经嵴源黑色素细胞的发育过程中起着重要的信号传递作用，Dharmayanthi et al[3]、Dorshorst et al[21]和Shinomiva et al[33]研究表明，EDN3是丝羽乌骨鸡黑色素沉积调控基因，其多拷贝重组的作用机制在来源于亚洲和欧洲色素过度沉积鸡品种中表现一致.黑色素在功能上具有抗紫外辐射的光保护性，与辐射响应相关的基因(ERCC8、PRKAA1)也受到了选择.这些贯穿于黑色素整个形成过程基因的选择作用，形成了金湖乌凤鸡全身性色素过度沉积的特征.

与国外商业化蛋鸡品种追求高产蛋不同，我国大多数地方鸡品种(尤其是交通闭塞地区分布品种)长期以来主要以家庭自给自足饲养方式，人为选留就巢性强母鸡个体用以孵化.金湖乌凤鸡就巢率高(近乎100%)，与就巢及母性行为相关的基因PRLR、CYP24A1、VIPR-1等受到了选择.与皮肤发育、内皮细胞分化增殖相关的基因THBS4、THAP1和DHCR24也受到了选择，这些基因的作用可能使得金湖乌凤鸡形成了较其它地方鸡种更厚的皮肤和粗大的毛孔.另外，T细胞信号通路、白细胞介素生成、嗜中性粒细胞趋化及免疫球蛋白生成等免疫基因(PDE4D、NFATC2、TNFAIP8等)也受到了选择，表明金湖乌凤鸡具有较强的抗病力.

综上所述，利用基因组SNP标记能更准确地揭示金湖乌凤鸡的遗传多样性和遗传结构，选择作用主要是体现在对金湖乌凤鸡黑色素沉积、皮肤发育、就巢行为及抗病特性等方面的塑造.