柏树果壳挥发油成分及其抗菌活性研究

李飞飞， 魏 悦， 范 毅， 宋梦娇， 王学方， 李自红

（1.河南省生物技术开发中心，郑州 450002； 2.河南科高中标检测技术有限公司，郑州 450002）

柏树（Platycladus orientalis（L.）Franco.）为柏科侧柏属的一种常绿乔木，在中国分布极广，北起内蒙古、吉林，南至广东及广西北部［1］. 柏树果壳是柏树结的果实外壳，柏树叶中富含叶绿素、黄酮、精油等活性成分，其中柏叶油可用于香皂、洗涤剂和其他日用化学品的加香. 黄酮类成分有明显的抗溃疡、止血、解痉、抗菌、抗炎、降血脂、镇痛、提高雌性激素等生物活性和生理活性作用［2-7］，是一类具有广泛开发前景的天然抗氧剂. 研究发现3-蒈烯［7］具有杀菌抗炎作用，蛇麻烯已发现具有抗炎作用，并有可能成为一种有效的治疗炎症性疾病或工具. β-水芹烯对储粮常见害虫具有明显的杀灭和抑制作用. 研究表明，柏树叶挥发油研究得比较多，而对柏树果壳的研究颇少，本课题组以柏树果壳（干壳）为原料，经过提取、干燥、浓缩得到柏树果壳挥发油，采用气质联用对其挥发油成分进行分析，并对其挥发油成分进行抗菌活性研究.

1 试验材料

1.1 原料与试剂

柏树果壳（干壳）采自安阳林州太行山脉；蒸馏水；无水硫酸钠（分析纯，650 ℃灼烧5 h）；甲醇（分析纯）；固体试剂干燥处理冷却后均于干燥器中密闭保存. 标准菌株鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311（批号14030301），肺炎链球菌ATCC49619（批号14040201），大肠埃希菌ATCC 25922（批号14030301），化脓性链球菌ATCC19615（批号14031401），金黄色葡萄球菌ATCC 29213（批号14030701），均购自南京便诊生物科技有限公司.

1.2 仪器与设备

气相色谱质谱联用仪GCMS-QP2010Ultra（日本岛津公司）；98-1-C电热套（天津泰斯特仪器有限公司）；JJ5000A电子天平（常熟市测试仪器有限公司）；ME204万分一天平（梅特勒-多利多国际股份有限公司）；超声波提取仪KQ-500E（昆山舒美超声仪器有限公司）.

2 实验方法

2.1 挥发油的提取

2.1.1 水蒸气蒸馏法 按照2015版中国药典第四部2204挥发油测定法测定［8］，将样品烘干、粉碎、过筛，称取100 g，用干净纱布分包置于2000 mL 圆底蒸馏烧瓶中，加入1500 mL 蒸馏水，浸泡过夜. 水蒸气蒸馏7 h至挥发油量不再增加为止，收集样品，用甲醇溶解挥发油，无水硫酸钠干燥过夜，次日用旋转蒸发仪常压浓缩，得淡黄色透明油状液体. 挥发油含量按式（1）计算，

2.1.2 超声波提取法 超声波法提取柏树果壳中石油醚效果最佳，因此选作石油醚提取溶剂. 称取10 g柏树果壳粉末置于三角瓶中，加入200 mL石油醚，40 ℃下提取1 h，提取液过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，得柏树果壳油.

2.1.3 索氏提取法 索氏提取法提取柏树果壳中石油醚效果最佳，因此选作石油醚提取溶剂. 称取10 g柏树果壳粉末用滤纸包好后放入索氏提取装置中，瓶内加入200 mL石油醚，100 ℃下提取3 h，提取液过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，得柏树果壳油.

2.2 挥发油的测定

2.2.1 气相色谱及质谱条件 Rxi-5ms色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；电离方式：EI；离子源温度：230 ℃；接口温度：270 ℃；进样口温度：260 ℃；程序升温：40 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至130 ℃，保持0.5 min，然后以5 ℃/min升至250 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至290 ℃；分流比：15∶1；吹扫流量：3.0 mL/min；溶剂延迟时间：5.0 min；质量扫描范围m/z：30～600 amu；电子能量：70 eV；进样量：1.0 μL；载气：氦气.

2.2.2 挥发油成分分析 取柏树果壳（干壳）挥发油的甲醇溶液1.0 μL，采用2.2.1中GC-MS 条件进行分析鉴定，得出总离子流色谱图. 对总离子流中的各色谱峰进行质谱扫描，通过NIST14标准质谱图库，并核对有关文献［9-13］，确定其化学成分. 采用峰面积归一化法进行定量分析，得出各化学成分在挥发油中的相对含量，化学分子式及化学名称.

2.3 体外抗菌活性的测定

2.3.1 菌株的复苏 将5种供试菌先进行斜面复苏，复苏后接种于固体培养基上，37 ℃培养12～24 h［14-16］.

2.3.2 菌悬液的制备 从固体平板上挑取单个菌落接种到液体培养基中，制成浓度为1×106～1×108CFU·mL-1的菌悬液［17-20］，备用.

2.3.3 抑菌圈的测定利用管碟法 测定索氏提取方法提取柏树果壳挥发油的抑菌圈活性. 其中，配制样品的质量浓度为50、100、200 mg/L，阳性药物阿莫西林的浓度为100 mg/L，每个平板涂布的菌液量为25 μL，每个牛津杯中添加的溶液量为200 μL. 之后将各平板于37 ℃培养24 h［15-16］，观察并测量抑菌结果.

3 结果与分析

3.1 不同提取方法挥发油含量的比较

本文采用3种不同的提取方法提取柏树果壳挥发油，分别按照式（1）进行计算，水蒸气蒸馏法、超声提取法和索氏提取法得到的挥发油含量分别为：2.7%、2.5%和3.0%. 根据含量选择采用索氏提取法，以石油醚做溶剂提取柏树果壳挥发油.

3.2 挥发油成分分析

根据2.2 项下的方法对柏树果壳油进行气质定性分析，总离子流色谱图见图1，确定了26 种化学成分，其化合物组成及相对含量见表1，从表中可知α-蒎烯相对含量三种提取方法都在55%以上，β-水芹烯和3-蒈烯相对含量在5%以上.

图1 柏树果壳（干壳）索氏提取挥发油的GC/MS总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of the soxhlet extraction volatile oil from the cypress nut shell（dry nut shell）

表1 柏树果壳（干壳）挥发油的化学成分Tab.1 Chemical constituents of the volatile oil from the cypress nut shell（dry nut shell）

续表

3.3 抑菌实验结果

采用2.3项下抑菌实验方法进行试验，结果见表2，柏树果壳挥发油在100 mg/L浓度下对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌抑菌效果较好，抑菌圈表明其显示高度敏感性.

表2 柏树果壳（干壳）挥发油对5种供试菌的抑菌圈检测Tab.2 Bacteriostatic circle detection of five test strains by the volatile oil from the cypress nut shell（dry nut shell）

4 结论

本实验采用水蒸气蒸馏、索氏提取和超声波提取3种方法提取柏树果壳油，比较了不同方法提取物的挥发油含量，结果表明，索氏提取挥发油含量较高，化学组成成分最多. 水蒸气蒸馏、超声提取和索氏提取物分别可鉴定出19、19、26种组分，占总含量的95%以上. 通过分析比较得出，柏树果壳（干壳）的挥发性化学成分主要有不饱和烯烃成分、酯类和甾醇类. 通过抑菌实验表明，柏树果壳挥发油在不同浓度下，对5种供试菌表现出不同程度的敏感性，相同浓度条件下，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大于对照药剂阿莫西林，化脓性链球菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌圈与对照药阿莫西林相当，柏树果壳挥发油的抑菌效果较好，为下一步研究开发奠定基础. 其中，挥发油中不饱和烯烃大部分可以用于香料制作的中间体，柏树叶、柏果和柏树果壳的化学成分是不相同的. 以往人们对柏树的研究只局限在柏叶和柏果，忽略了柏树果壳，没能充分认识柏树的完整价值，柏树果壳（干壳）的化学成分和产品开发研究还有待进一步的深入.