帕金森病大鼠模型形态学实验研究及行为学评价*

刘梅梅 杨 珺 黄焱平 季 丹

（安徽医学高等专科学校人体解剖学与组织胚胎学教研室 安徽合肥 230601）

帕金森病（parkinson"s disease，PD）是一种进行性神经退行疾病，以脑黑质多巴胺能神经元变性、死亡和纹状体系统多巴胺（dopamine，DA）含量减少为特征，临床表现为静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓等，目前发病机制尚不清楚。该研究采用改良的Thomas方法［1］即前脑束单侧两点注射6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）建立PD大鼠模型，通过行为学检测以及病理学观察，探讨PD大鼠行为学变化的病理学基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物、试剂药品和仪器

1.1.1 实验动物 Spague-Dawlay（SD）大鼠60只，雄性，体重200～220g，由安徽医科大学实验动物中心提供（皖医实动准第01号）。动物自由进食、饮水，喂标准颗粒饲料，室温18～22℃，实验前对其行为学测试，无异常。

1.1.2 实验试剂与药品 6-OHDA、水合氯醛、阿朴吗啡（APO）、明胶、HE染色试剂盒等。

1.1.3 实验仪器 脑立体定位仪、MT-200 Morris水迷宫视频跟踪分析系统、冷冻切片机、光学显微镜。

1.2 方法

将SD大鼠随机分成对照组和模型组各30只，对照组大鼠正常饲养，其余大鼠建立PD模型并测试。

1.2.1 PD大鼠模型的建立 SD大鼠用7%的水合氯醛（0.6mL／100g）腹腔注射麻醉后，将大鼠头颅水平位固定在脑立体定位仪上，剃除大鼠头顶毛发，手术区常规消毒，沿头颅正中剪开头皮和骨膜，使其前囟充分暴露，确定大鼠右侧前脑内侧束损伤坐标位置［2］。右侧黑质致密部：AP＝-4.7mm，ML＝-1.3mm，V＝-7.7mm；中脑腹侧被盖部：AP＝-4.4mm，ML＝-0.9mm，V＝-7.9mm。将6-OHDA、VitC按2.5：1的比例用生理盐水制成0.3%的注射液备用。用电动颅骨钻钻颅孔2个，微量注射器抽取0.3%6-OHDA，每孔注射4.2μL，注射速度0.5μL／min，注射完毕后留针10min，缓慢拔针。用明胶海绵填塞颅孔，缝合皮肤及筋膜，术后注意大鼠保暖及护理，清醒后正常喂养。

1.2.2 APO诱导旋转实验 术后第7d进行大鼠行为学观察，通过腹腔注射APO（0.5mg／kg）诱导大鼠旋转，用旋转仪测量大鼠旋转次数，取每30min转圈数≥210转的大鼠作为PD模型组［3］，共20只。

1.2.3 旷场实验 采用100cm×100cm×40cm（长×宽×高）的木质旷场箱，箱底平均分为25个方格（20cm×20cm），内侧壁涂黑，侧壁的格子为外周区域，其余为中央区域［4］。将大鼠放置在中央区域观察5min，记录大鼠在中央区域的停留时间、直立次数和运动总距离。

1.2.4 露台水迷宫实验 采用Morriss水迷宫装置［5］，将水池分为四个象限，将露台置于水迷宫装置的某一象限上，训练大鼠从露台所在位置的对侧象限头朝池壁入水，时间设定为120s，记录大鼠从入水到找到露台的时间、游泳轨迹（运动总距离）及寻台速度。

1.2.5 组织学检测 ①制备脑组织冷冻切片。取正常组大鼠和模型组大鼠各2只，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，固定大鼠，剪开胸腔暴露心脏，从左心室插入导管注入生理盐水，再灌注4%的多聚甲醛，持续60min，待大鼠全身僵硬后取脑，用生理盐水冲洗，常规固定、脱水。20μm冠状切片晾干后放入-80℃冰箱中保存备用。②苏木精-伊红（HE）染色。将冷冻切片放入AFF固定液中固定1min，蒸馏水冲洗后苏木精染色10min，蒸馏水洗，1%酒精盐酸分化，蒸馏水洗，1%氨水反蓝；伊红染色1min，蒸馏水洗，脱水、透明、封片。光学显微镜下观察黑质区神经元形态变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 行为学检测

2.1.1 旷场实验 PD模型组大鼠的直立次数和运动总距离均明显少于对照组大鼠，且对照组大鼠在中央格区域停留的时间明显短于模型组大鼠，差异具有统计学意义（p＜0.01），详见表1。

表1 旷场实验数据统计表

2.1.2 露台水迷宫实验 对照组大鼠的寻台速度显著快于PD模型组大鼠，且寻台时间明显短于模型组大鼠，差异有统计学意义（p＜0.01），详见表2。

表2 露台水迷宫实验数据统计表

2.2 HE染色下观察大鼠黑质区神经元变化

高倍镜下观察PD模型组大鼠黑质区致密部神经元胞体形态各异，大小不均一，数量明显少于对照组，详见图1。

图1 HE染色下对照组和模型组大鼠黑质区神经元变化

3 讨论

多巴胺能神经元主要位于中脑黑质致密带，当其变性死亡时，会引起纹状体内多巴胺水平的降低。该实验将6-羟基多巴胺（6-OHDA）注射到大鼠前脑束（MFB）后，多巴胺能神经纤维吸收6-OHDA并运输到黑质致密部发挥其毒性作用，多巴胺能神经元传导通路被阻断，最终导致黑质致密区多巴胺能神经元数量减少或者变性，成功建立PD大鼠模型。该实验采用多点注射的方法，提高了制模的成功率和稳定性。PD大鼠模型在其病理和生化等方面的改变和人类PD有很多相似之处［6］，可以为深入研究PD以及药物的疗效观察和毒性作用机制等方面提供实验基础。

该实验采用旷场实验观察并评价PD大鼠自主运动行为能力的变化。结果显示，模型组大鼠直立次数、中央格停留时间、运动速度及运动总距离显著低于对照组，表明PD模型大鼠运动行为能力下降、运动协调性降低。露台水迷宫实验是用于检测动物学习记忆及空间认知能力的神经行为学方法，实验中模型组大鼠和对照组大鼠相比寻台速度明显下降，寻台时间显著延长，表明PD大鼠出现典型的运动功能障碍。HE染色下，模型组大鼠中脑黑质致密区神经元数量减少，尼氏体出现部分溶解消失，证明了采用内侧前脑束单侧两点注射6-OHDA是建立PD大鼠模型的有效方法，同时也提示PD大鼠的行为学变化有其病理学基础。